RNA连接酶在寡核苷酸制备上的应用
本发明提供了一种RNA连接酶在寡核苷酸制备上的应用。其中，RNA连接酶包括包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3、Rnl5中任意的一种或多种酶，寡核苷酸包括天然RNA或非天然RNA。能够解决现有技术中难以高效合成非天然RNA链的问题，适用于RNA合成领域。
发明专利
CN202211107027.1
2022-09-08
CN117660374A
2024-03-08
C12N9/00(2006.01)
凯莱英医药集团(天津)股份有限公司
洪浩;詹姆斯·盖吉;张娜;焦学成;王召帅;刘芳;马翠萍;耿宇菡;杨益明;李娟;崔丽心;朱文轩;贾旭
300457 天津市滨海新区经济技术开发区洞庭三街6号
北京康信知识产权代理有限责任公司
路秀丽
天津;12
1.RNA连接酶在寡核苷酸制备上的应用，其特征在于， 所述RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3、Rnl5中任意的一种或多种酶， 所述寡核苷酸包括天然RNA或非天然RNA。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ ID NO：1～55所示的任意一种或多种酶； 优选地，所述应用包括： a)将模版链与RNA底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的双链核酸结构，所述RNA底物的数量为2～10个，优选为2～3个； b)利用所述RNA连接酶将所述缺刻以磷酸二酯键连接； 其中，所述磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸； 优选地，所述非天然核糖核苷酸包括：具有戊糖环2’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸； 优选地，所述戊糖环2’位修饰包括2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰、2’-三氟甲氧基修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-烯丙基修饰、2’-氨基修饰或2’-叠氮基修饰； 优选地，所述磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰； 优选地，所述碱基修饰包括在碱基的N1、N5或N6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰和/或乙酰化修饰。 3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，每个所述RNA底物为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的RNA片段； 优选地，所述核糖核苷酸均为所述非天然核糖核苷酸； 优选地，所述模版链包括单链RNA模版或单链DNA模版。 4.一种单链RNA制备方法，其特征在于，所述单链RNA制备方法包括： a)将单链DNA模版与RNA底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的DNA-RNA杂交双链，所述RNA底物的数量为2～10个； b)利用RNA连接酶将所述缺刻以磷酸二酯键连接，形成连续DNA-RNA杂交双链； c)去除所述连续DNA-RNA杂交双链中的DNA链，获得所述单链RNA； 其中，所述RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3、Rnl5中任意的一种或多种酶； 所述磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸。 5.根据权利要求4所述的单链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ IDNO：1～55所示的任意一种或多种酶； 优选地，利用DNA酶降解去除所述连续DNA-RNA杂交双链中的DNA链； 优选地，所述DNA酶包括DNaseI、DNase1L1或DNase1L2； 优选地，所述RNA底物长度为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的RNA片段； 优选地，所述核糖核苷酸均为所述非天然核糖核苷酸； 优选地，所述非天然核糖核苷酸包括：具有戊糖环2’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸； 优选地，所述戊糖环2’位修饰包括2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰、2’-三氟甲氧基修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-烯丙基修饰、2’-氨基修饰或2’-叠氮基修饰； 优选地，所述磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰； 优选地，所述碱基修饰包括在碱基的N1、N5或N6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰和/或乙酰化修饰； 优选地，所述RNA底物的数量为2～3个。 6.根据权利要求4所述的单链RNA制备方法，其特征在于，所述单链RNA包括链式单链RNA、半环式单链RNA或全环式单链RNA。 7.一种双链RNA制备方法，其特征在于，所述双链RNA制备方法包括： a)将单链RNA模版与RNA底物混合、退火、特异性结合，形成带有缺刻的双链RNA，所述RNA底物的数量为2～10个； b)利用RNA连接酶将所述缺刻以磷酸二酯键连接，形成所述双链RNA； 其中，所述RNA连接酶包括RNA连接酶家族Rnl1、Rnl2、Rnl3、Rnl5任意的一种或多种酶； 所述磷酸二酯键连接的核糖核苷酸均为非天然核糖核苷酸。 8.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA连接酶包括SEQ IDNO：1～55所示的任意一种或多种； 优选地，所述单链RNA模版包括利用权利要求4至6中任一项所述的单链RNA制备方法制备的单链RNA； 所述双链RNA包括链式双链RNA、半环式双链RNA或全环式双链RNA。 9.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA底物为2～100nt，优选为2～10nt，更优选为4～6nt的RNA片段； 优选地，所述RNA底物的数量为2～3个。 10.根据权利要求7所述的双链RNA制备方法，其特征在于，所述RNA底物的核糖核苷酸均为所述非天然核糖核苷酸； 优选地，所述非天然核糖核苷酸包括：具有戊糖环2’位修饰、磷酸根α位修饰或碱基修饰中的一种或多种的核糖核苷酸； 优选地，所述戊糖环2’位修饰包括2’-甲氧基修饰、2’-氟修饰、2’-三氟甲氧基修饰、2’-甲氧乙基修饰、2’-烯丙基修饰、2’-氨基修饰或2’-叠氮基修饰； 优选地，所述磷酸根α位修饰包括磷酸根α位硫代修饰； 优选地，所述碱基修饰包括在碱基的N1、N5或N6位中任意一处或多处进行的甲基化修饰和/或乙酰化修饰。