2-戊酰基苄腈还原酶突变体及在制备光学纯丁苯酞中的应用
本发明涉及2‑戊酰基苄腈还原酶突变体及在制备光学纯丁苯酞中的应用，具体是一种活性、稳定性和对映选择性提高的2‑戊酰基苄腈还原酶突变体，其编码的基因，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化子，以及利用所述2‑戊酰基苄腈还原酶突变体作为催化剂用于催化2‑戊酰基苄腈化合物的不对称还原，特别是催化2‑戊酰基苄腈不对称还原以制备光学纯的正丁基苯酞(丁苯酞)的应用。与现有技术相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有良好的应用前景。
发明专利
CN202211072770.8
2022-09-02
CN115927227A
2023-04-07
C12N9/04(2006.01)
华东理工大学
白云鹏;宋渴明;张晓彦
200237 上海市徐汇区梅陇路130号
上海科盛知识产权代理有限公司
褚明伟
上海;31
1.一种2-戊酰基苄腈还原酶突变体，其特征在于，将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺、第92位天冬氨酸、183位酪氨酸、90位苏氨酸、127位赖氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质，所述衍生蛋白质具有高于SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的催化性能和热稳定性。 2.根据权利要求1所述的一种2-戊酰基苄腈还原酶突变体，其特征在于，所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体的氨基酸序列选自下列序列中的任一种： (1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸； (2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第92位天冬氨酸替换为酪氨酸； (3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第183位酪氨酸替换为亮氨酸； (4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第90位苏氨酸替换为蛋氨酸； (5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位赖氨酸替换为精氨酸； (6)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第92位天冬氨酸替换为酪氨酸； (7)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第92位天冬氨酸替换为酪氨酸，第183位酪氨酸替换为亮氨酸； (8)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第92位天冬氨酸替换为酪氨酸，第183位酪氨酸替换为亮氨酸，第90位苏氨酸替换为蛋氨酸； (9)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第92位天冬氨酸替换为酪氨酸，第183位酪氨酸替换为亮氨酸，第127位赖氨酸替换为精氨酸； (10)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第145位天冬酰胺替换为精氨酸，第92位天冬氨酸替换为酪氨酸，第183位酪氨酸替换为亮氨酸，第90位苏氨酸替换为蛋氨酸，第127位赖氨酸替换为精氨酸。 3.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1或2所述的2-戊酰基苄腈还原酶突变体。 4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求3所述的核酸。 5.一种重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体包含如权利要求4所述的重组表达载体。 6.一种重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂，其特征在于，所述的重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂是以下形式中的任意一种： (1)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体的转化体细胞； (2)培养如权利要求5所述的重组表达转化体，分离含有所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体的粗酶液； (3)将所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体的粗酶液干燥得到的粗酶粉。 7.一种如权利要求1或2所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体，或权利要求6所述重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂在不对称还原2-戊酰基苄腈化合物中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体或重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂在不对称还原2-戊酰基苄腈化合物的过程中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖、辅酶NADPH或NADP+存在的情况下进行。 9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的用量为50～200U/mmol 2-戊酰基苄腈化合物，所述葡萄糖的用量为2-戊酰基苄腈化合物摩尔量的1.5倍，所述辅酶NADPH或NADP+的用量为0.1～0.5mmol/L。 10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述2-戊酰基苄腈化合物的浓度为2～20mmol/L，所述2-戊酰基苄腈还原酶突变体或所述重组2-戊酰基苄腈还原酶突变体催化剂的用量为5～20U/mmol 2-戊酰基苄腈化合物。