ODC基因的缺失在获得浓香型水稻中的应用
本发明公开了ODC基因的缺失在获得浓香型水稻中的应用，开发了快速鉴定ODC缺失的分子标记。本发明还公开了通过CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，基于ODC的序列特征，设计靶序列，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，转化没有香味的水稻，对基因编辑材料编辑位点的鉴定和cas9的PCR检测，获得了没有cas9的香味水稻。本发明ODC基因的缺失水稻，相较于野生型水稻，香味物质2‑AP含量提高了1倍。本发明通过将ODC缺失的品种与常规Badh2缺失的香味水稻进行杂交，可以获得浓香型水稻材料。本发明具有简单便捷、快速高效的获得香味水稻，对水稻香味品质改良育种具有指导意义。
发明专利
CN202211017034.2
2022-08-24
CN117625675A
2024-03-01
C12N15/84(2006.01)
江苏省农业科学院
王金彦;张保龙;李阳;凌溪铁;郭冬姝
210014 江苏省南京市玄武区钟灵街50号
南京苏高专利商标事务所(普通合伙)
王艳
江苏;32
1.一种获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述方法包括：下调水稻的鸟氨酸脱羧酶的表达或活性，所述鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的下调水稻的鸟氨酸脱羧酶的表达或活性的方法包括：在水稻的基因组中敲除或沉默ODC基因；或下调ODC基因转录、多肽表达或多肽活性的下调剂转入水稻中，或采用ODC缺失的水稻品种与香味型水稻品种进行杂交。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的下调剂为特异性干扰ODC基因表达的干扰分子，所述的干扰分子为抑制或沉默ODC基因或其转录本的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA、sgRNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。 4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，下调后的水稻的ODC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3所示，下调后的水稻的鸟氨酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4所示。 5.基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述方法为设计用于编辑ODC基因的sgRNA识别位点的靶序列，将其构建CRISPR/Cas9-ODC基因编辑载体，将该载体转化水稻获得浓香型水稻。 6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述的sgRNA识别位点的靶序列为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示。 7.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，所述CRISPR/Cas9-ODC基因编辑载体的构建方法如下： （a）靶点接头的制备：将接头引物对ODC Spacer1 F和ODC Spacer1 R混合高温变性后退火，即获得靶点接头ODC spacer1；同样，将将接头引物对ODC Spacer2 F和ODC Spacer2R混合高温变性后退火，即获得靶点接头ODC spacer2； （b）sgRNA连接产物的制备：采用pYLsgRNA-OsU3中间载体、靶点接头ODC spacer1、DNA连接酶、BsaI 进行连接反应获得sgRNA1连接产物；采用同样的方法连接靶点接头ODCspacer2，得到sgRNA2连接产物； （c） 扩增sgRNA的表达盒：分别以引物组合1和引物组合2对sgRNA1连接产物进行第一轮PCR扩增获得第一轮PCR产物1和第一轮PCR产物2，然后以扩增引物对1对第一轮PCR产物1和第一轮PCR产物2进行第二轮PCR，获得的PCR产物即为sgRNA1表达盒；以同样的方法对sgRNA2连接产物进行第一轮PCR扩增获得第一轮PCR产物3和第一轮PCR产物4，然后以扩增引物对2对第一轮PCR产物3和第一轮PCR产物4进行第二轮PCR，获得的PCR产物即为sgRNA2表达盒； （d）将sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒连接到CRISPR/Cas9表达载体上，获得连接产物； （e）将步骤（d）的连接产物进行热激转化大肠杆菌获得重组菌，提取含有目的条带的阳性质粒。 8.根据权利要求6所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求7中所获得的含有目的条带的CRISPR/Cas9基因编辑载体转入农杆菌EHA105中，转化水稻，获得T0代转基因植株，以扩增引物对3对T0代转基因植株进行扩增并测序鉴定获得ODC缺失突变的植株。 9.根据权利要求8所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述扩增引物对3为SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。 10.根据权利要求8所述的利用CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述方法还包括将含有ODC基因突变的T0代转基因植株，自交后的T1代植株的T-DNA载体的剔除，所述T-DNA载体包括潮霉素磷酸转移酶基因HPT、核酸酶基因Cas9和sgRNA编码基因。 11.根据权利要求10所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述T-DNA载体的剔除通过对含有ODC基因突变的T1代植株的HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因同时检测，重复多次，筛选得到不携带这三个基因的T1代单株即为目标植株。 12.根据权利要求11所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，HPT基因表达盒检测方法通过以ODC基因突变的 T1代植株的基因组DNA为模板，以引物35S-NTF1和引物HYG-TR2进行PCR扩增，同时，Cas9基因表达盒检测方法通过以ODC基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以引物UBI-F1-NEW和引物CL-R2-NEW进行PCR扩增，同时，sgRNA编码基因检测方法通过以ODC基因突变的T1代植株的基因组DNA为模板，以引物ODC-F2和引物ODC-R3进行PCR扩增，当均未同时检测到HPT基因、Cas9基因和sgRNA编码基因，表明成功剔除了T-DNA。 13.根据权利要求12所述的基于CRISPR/Cas9技术快速获得浓香型水稻的方法，其特征在于，所述引物35S-NTF1：所述引物35S-NTF1如SEQ ID NO.19所示，引物HYG-TR2如SEQ IDNO.20所示，所述引物UBI-F1-NEW如SEQ ID NO.21所示，引物 CL-R2-NEW如 SEQ ID NO.22所述，引物 ODC-F2如SEQ ID NO.17所示，引物ODC-R3如SEQ ID NO.18所示。 14.鉴定ODC缺失的分子标记，所述分子标记为ODC-M1F和/或ODC-M1R，ODC-M1F的碱基序列如SEQ ID NO.23所示，所述ODC-M1R的碱基序列如SEQ ID NO.24所示。 15.权利要求14所述的鉴定ODC缺失的分子标记在鉴定浓香型水稻品种中的应用。 16.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述采用ODC缺失的水稻品种与香味型水稻品种进行杂交的方法中，所述ODC缺失的水稻品种为ODC基因编辑植株，所述香味型水稻品种为Badh2缺失的水稻品种。