GDF15基因甲基化检测方法
本发明公开了GDF15基因甲基化检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，样本收集；步骤三，核酸提取；步骤四，亚硫酸氢盐转化；步骤五，甲基化检测；本发明采用耐U特异性Taq酶进行PCR扩增，避免了普通Taq酶和高保真Taq酶与亚硫酸氢盐转化过程中大量未甲基化的C转变为U，造成无法PCR扩增的情况出现；利用以亚硫酸氢盐转化产物为模板，分别测试不同退火温度下的PCR扩增情况，温度梯度为55℃，56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，61℃，62℃，保证适宜的反应温度；对于GDF15基因甲基化修饰的实验流程合理高效，对不同浓度的引物进行测试，得出0.4μM浓度的时候的GDF15‑F4/R4引物对的扩增效果最好，有利于保证引物对的合理选择。
发明专利
CN202210975288.9
2022-08-15
CN117625755A
2024-03-01
C12Q1/6858(2018.01)
北京大学第一医院
李学松;周利群;何世明;熊耕砚;夏漫城
100034 北京市西城区西什库大街八号
北京三聚阳光知识产权代理有限公司
张均莹
北京;11
1.GDF15基因甲基化检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，样本收集；步骤三，核酸提取；步骤四，亚硫酸氢盐转化；步骤五，甲基化检测；其特征在于： 其中在上述步骤一中，首先选取GDF15基因chr 19:18,387,170-18,389,169(GRCh38)位置序列作为目标序列，将序列输入网址进行CpG岛甲基化修饰预测，以得到的转化序列作为模板，设计覆盖GDF15基因甲基化检测的特异性引物，设计4组引物对； 其中在上述步骤二中，当步骤一中的引物对设计完成后，利用100ml的采样杯采集适量待测的尿液备用； 其中在上述步骤三中，核酸提取包括以下步骤： 1)将步骤二中采集的尿液分入两根离心管，分别做上标记，配平后利用离心机进行离心，在4000g下离心10min； 2)离心完成后将离心管从离心机中取出，拧开盖子后小心移除上清，留存1-2ml尿液，加入10ml 1x PBS溶液，用1ml移液器吹打重悬沉淀，配平后离心4000g，离心10min； 3)离心完成后，拧开盖子后用移液器小心移除上清，加入1.5ml 1xPBS溶液，重悬沉淀，转移到1.5ml离心管中，标记好后放入台式离心机，4000g离心10min； 4)取出离心管，移除上清，留下沉淀，随后向沉淀中加入220μlPBS，10μl RNasesolution和20μl Proteinase K，重悬细胞，常温静置一段时间； 5)加入250μl Buffer GB至细胞悬液中，涡旋混匀，在金属浴65℃600rpm放置15min； 6)加入180μl无水乙醇至消化液中，涡旋混匀15sec； 7)将gDNAColumns吸附柱置于Collection Tubes收集管中，将上一步所得混合液转移到收集柱中，12000rpm，离心1min； 8)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入500μlWashing Buffer A至吸附柱中，12000rpm，离心1min； 9)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入650μlWashing Buffer B至吸附柱中，12000rpm，离心1min， 10)随即重复9)的操作； 11)将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min； 12)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min； 13)加入50μl预热至70℃的Elution Buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置3min，12000rpm，离心1min； 14)弃掉吸附柱，取1μl用Qubit4.0进行核酸浓度测定，记录浓度，取2μl用Nanodrop进行纯度测定和浓度测定，要求OD260/280在1.8-1.9区间，从而完成核酸地提取，提取的核酸备用； 其中在上述步骤四中，当步骤三中的核酸提取完成后，进行亚硫酸氢盐转化，步骤包括： 1)配制CT Conversion mix：取一管CT Conversion Powder，12000rpm离心2min，加入1ml无核酸酶水，200μl CT Conversion Diluent，100μlCT Conversion Buffer，震荡混匀，期间注意防止液体遗洒，确保粉末完全溶解； 2)在200μl灭菌PCR管中配制如下反应： Input DNA Xμl 100pg-2μg CT Conversion mix 130μl Nuclease free water to 150μl 混匀后取75μl转移到另外一个200μl灭菌PCR管中，震荡混匀后瞬时离心； 3)将PCR管置于PCR仪中，进行反应，反应完成后备用； 4)将EpiArt DNA columns吸附柱置于Collection Tubes中，做好标记； 5)加入600μl E-Binding Buffer至吸附柱中，然后将转化产物加入吸附柱中，闭盖，颠倒混匀8-10次，使反应液与E-Binding Buffer完全混匀； 6)12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中； 7)加入500μl E-Wash Buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中； 8)加入500μl E-Desulphonation Buffer至吸附柱中，闭盖后室温放置15min，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中； 9)加入500μl E-Wash Buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min； 10)重复上述步骤9)； 11)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min； 12)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min； 13)加入20μl E-Elution Buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置2min，12000rpm，离心2min； 14)弃掉吸附柱，取1μl用Qubit4.0进行核酸浓度测定，记录浓度，其余样本放在－20℃冻存或4℃备用，从而制成转化后的DNA模板备用； 其中在上述步骤五中，当步骤四中的亚硫酸氢盐转化完成后，进行GDF15基因甲基化序列检测，步骤如下： 1)稀释冻干引物至100μM，将引物对分装成10μM的工作液； 2)配制反应体系：4组引物分别进行扩增，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为商品化的人HCT116细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板，阴性对照为健康人血细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板； 3)选取12.5μL的2x EpiArt HS Taq Master mix、2μL的引物、9.5μL的无核酸酶水、1μL的转化后的DNA模版进行PCR扩增； 4)扩增完成后进行电泳检测，然后用凝胶成像系统观察电泳结果， 并记录结果。 2.根据权利要求1所述的GDF15基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤一中，四组引物对分别为： 1)GDF-F1，正向序列AGGCGTTCGCGTTGTATTTG，GDF-R1，反向序列CACCTCCCGTAACGACAACA； 2)GDF-F2，正向序列GTCGTCGTCGTGGTGAGATT，GDF-R2，反向序列CCCCTAACGACTTACGACCG； 3)GDF-F3，正向序列TATGTGTATCGGCGCGTGTT，GDF-R3，反向序列CCATCAAACCAACCCCCGAA； 4)GDF-F4，正向序列CGGCGGTTATTTGTATTTGC，GDF-R4，反向序列CCCTAACGACTTACGACCGC。 3.根据权利要求1所述的GDF15基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤三中，静置的时间为15-20min。 4.根据权利要求1所述的GDF15基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤四中，PCR仪中的反应为：98℃下反应10min，随后64℃下反应40min，随即98℃下反应5min，然后64℃下反应40min，随即98℃下反应5min；继而64℃下反应40min，随后4℃下hold，最后热盖105℃。 5.根据权利要求1所述的GDF15基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤五中，扩增的程序为：95℃下扩增5min，随后95℃扩增30sec、57℃扩增30sec和72℃扩增30sec为一个循环，循环35次，完成后72℃下扩增5min，12℃下hold，最后热盖105℃。 6.根据权利要求1所述的GDF15基因甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤五中，电泳的条件为：配制2％琼脂糖凝胶，使用1x TAE缓冲液进行电泳，100bp DNA Ladder作为分子量marker，150V电压恒压20min。