TMEFF2基因启动子甲基化检测方法
本发明公开了TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，样本收集；步骤三，样本核酸提取；步骤四，亚硫酸氢盐转化；步骤五，TMEFF2基因启动子区甲基化序列检测；本发明相较于现有的TMEFF2生物标志物蛋白水平的检测，通过对TMEFF2基因甲基化状态进行检测，可以更早的发现基因表达水平的变化，能够在早期发现相应标志物的表达趋势，进而对疾病状态做出相应的预测，有利于判断受检者的患病风险，实现早筛早诊；本发明采用了最优的Taq酶、退火温度、引物对、引物浓度和模板input量设计，以及精确的参数控制，保证了检测结果的准确性，所提供的详细操作过程对基因甲基化检测具有重要的指导意义。
发明专利
CN202210974727.4
2022-08-15
CN117587123A
2024-02-23
C12Q1/6886(2018.01)
北京大学第一医院
周利群;李学松;熊耕砚;何世明;夏漫城
100034 北京市西城区西什库大街八号
北京三聚阳光知识产权代理有限公司
张均莹
北京;11
1.TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，包括以下步骤：步骤一，引物设计；步骤二，样本收集；步骤三，样本核酸提取；步骤四，亚硫酸氢盐转化；步骤五，TMEFF2基因启动子区甲基化序列检测；其特征在于： 其中在上述步骤一中，首先选取TMEFF2基因-1000～1000bp位置序列作为启动子区序列，然后进行启动子区CpG岛甲基化修饰预测，以得到的启动子区转化序列作为模板，设计覆盖TMEFF2基因启动子区甲基化检测的特异性引物； 其中在上述步骤二中，收集尿液100ml，置于采样杯中； 其中在上述步骤三中，样本核酸提取包括以下步骤： 1)将尿液样本放入离心管中，共两管，做好标记，配平后离心，条件为4000g离心10min； 2)将离心管从离心机中取出，拧开盖子后小心移除上清液，留存1-2ml尿液，加入10ml1x PBS溶液，用1ml移液器吹打重悬沉淀，配平后离心，条件为4000g离心10min； 3)将离心管从离心机中取出，拧开盖子后用移液器小心移除上清液，加入1.5ml 1xPBS溶液，重悬沉淀，转移到1.5ml离心管中，标记好后离心，条件为4000g离心10min； 4)小心移除上清液，备用； 5)往沉淀中加入220μl PBS，10μlRNase solution和20μl Proteinase K，重悬细胞，室温静置15min以上； 6)加入250μl Buffer GB至细胞悬液中，涡旋混匀，在金属浴65℃，600rpm放置15min； 7)加入180μl无水乙醇至消化液中，涡旋混匀15sec； 8)将gDNA Columns吸附柱置于Collection Tubes收集管中，将上一步所得混合液转移到收集柱中，12000rpm，离心1min； 9)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入500μl Washing Buffer A至吸附柱中，12000rpm，离心1min； 10)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，加入650μlWashing Buffer B至吸附柱中，12000rpm，离心1min； 11)重复步骤10； 12)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min； 13)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min； 14)加入50μl预热至70℃的Elution Buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置3min，12000rpm，离心1min； 15)弃掉吸附柱，取1μl用Qubit4.0进行核酸浓度测定，记录浓度，取2μl用Nanodrop进行纯度测定和浓度测定，要求OD260/280在1.8-1.9区间； 其中在上述步骤四中，亚硫酸氢盐转化包括以下步骤： 1)配制CT Conversion mix：取一管CT Conversion Powder，12000rpm离心2min，加入1ml无核酸酶水，200μl CT Conversion Diluent，100μl CT Conversion Buffer，震荡混匀，期间注意防止液体遗洒，确保粉末完全溶解； 2)在200μl灭菌PCR管中配制如下反应： Input DNA Xμl(100pg-2μg，建议100ng-1μg) CT Conversion mix 130μl Nuclease free water to 150μl 混匀后取75μl转移到另外一个200μl灭菌PCR管中，震荡混匀后瞬时离心； 3)将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：98℃10min；64℃40min；98℃5min；64℃40min；98℃5min；64℃40min；4℃hold；热盖105℃； 4)将EpiArt DNA columns吸附柱置于Collection Tubes中，做好标记； 5)加入600μl E-Binding Buffer至吸附柱中，然后将转化产物加入吸附柱中，闭盖，颠倒混匀8-10次，使反应液与E-Binding Buffer完全混匀； 6)12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱重新放回收集管中； 7)加入500μl E-Wash Buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中； 8)加入500μl E-Desulphonation Buffer至吸附柱中，闭盖后室温放置15min，12000rpm，离心1min，弃滤液，将吸附柱置于收集管中； 9)加入500μl E-Wash Buffer至吸附柱中，12000rpm，离心1min； 10)重复步骤9； 11)弃滤液，将吸附柱置于收集管中，12000rpm，空管离心2min； 12)将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，管盖做好标记，开盖室温放置2min； 13)加入20μl E-Elution Buffer至吸附柱膜中央，闭盖后室温放置2min，12000rpm，离心2min； 14)弃掉吸附柱，取1μl用Qubit4.0进行核酸浓度测定(ssDNA assay kit)，记录浓度，其余样本放在-20℃冻存或4℃备用； 其中在上述步骤五中，TMEFF2基因启动子区甲基化序列检测包括以下步骤： 1)稀释冻干引物至100μM，将引物对分装成10μM的工作液； 2)配制反应体系：4组引物分别进行扩增，同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为商品化的人HCT116细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板，阴性对照为健康人血细胞基因组亚硫酸氢盐转化模板； 3)电泳检测：配制2％琼脂糖凝胶，使用1x TAE缓冲液进行电泳，100bp DNA Ladder作为分子量marker，150V电压恒压20min，然后用凝胶成像系统观察电泳结果。 2.根据权利要求1所述的TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤一中，将序列输入以下网址进行启动子区CpG岛甲基化修饰预测：https://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi。 3.根据权利要求1所述的TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤一中，启动子区转化序列模板如下： TGTTTGGGTTAATAAATGGAGTTCGTTTTTTTTTTTTCGGACGTCGTTGTTCGGTCGATTTTTCGGTAATTTATTCGCGGCGTATGTAGAGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTAGATTATTTGTTTCGATTAATTTGATTTTTTAAATATATTTGATCGTATTTTTTAGGTGGATATATTAATAGGTTACGGGTTGGAGAGGAGCGGGTGATGAGGAGAGGGATTTAAATTTGCGAACGTTTGGGTTGGGTCGGAGTTGCGGGGGGTTTGGGAGGAGAGAGGGGAGAAGAGAGAAGGAAGGAGAGCGTTTGTCGGGATGGTTGAGTTGTTTCGGCGAGTAGTTTTGGGGTTGTACGTTTTTGTGGGAGATGTTGTTGTTGTTTTTAGGTCGGTAAGAGCGGTTTTAATATTATCGTTTTTTATTTTTTTTTTTGTAAATTTTTAGAGAAACGTTTTTGGTTTTTTCGTCGCGATATTTTTAGTTTGTATTTTTTTATAGTTTAGGCGGCGCGTTTTCGTACGTTGGAGCGTCGGTCGTTAGTAGGACGTTTTTTTTCGCGTCGATTCGTTTTTTTTTGTTTTGTTGTTGTTGTTTTTTTGATATTTTCGTTTTTATTATTTTTAGTTCGGAGAGACGTTATTTAGTCGCGGTTCGTATTCGCGGTTCGGGGTTACGCGCGGAAGAGGGGCGTTAGTTCGGATTTCGTTTTCGGTAGGGGGCGTTTTGGAGCGGAGAGTGAGGCGAATGGTATATGAGTGTGCGGGTAGTTTATTTTGAAGTTCGAGTTTTTTATTTGAGTTATTTTCGTTTAGTTTTATTCGGGTTAGCGTTTGGCGAGCGAGTTTATTTGTGGTTTTCGCGGTCGTTTTTTTTTTGTATTTTTGTATTTTTTCGTCGATTTTTTTTTTTCGGGATTTGTATTTTGTTTTATTAATTAGAGTTCGATTGTTTTTTTTTACGTGATTTCGGGCGGGTTGAGGATTTGTTGTTTTTTAAACGTTAGAGGGATGCGGGCGGTAGAGTTCGAGAGGCGGTTGTCGGGTTGCGGGGCGTTTTGATTTTTTTTTTATTTTGTTTTTTCGGGTTTTATTCGTTTGTTTTTGGATTTTCGTTTTTTTTTGTTTTTCGGTTTTTTAGAGTTTTTTTTTTATGGTAGTAGTTTTTCGCGTTTTCGGCGTAGTTTTTTAGCGGACGATTTTTTCGTTTCGGGGTTGAGTTTAGTTTTTGGATGTTGTTGAAATTTTCGAGATTATGCGCGGGTTTGGTTGTTGTTTTTTCGTCGGGTGTTATTGTTATCGTCGTCGTTTTTGTTGTCGTCGTTCGCGGGATGTTTAGTAGTTCGTTGTTCGGTTTTCGCGATTTTGTGTTTTTCGGAAGTCGTTTGTTGTTGTAGAGTTGTACGAATTAGTTATGGTGTTGTGGGAGTTTTCGCGGTAGTGTAGTAGTTGGATATTTTGCGAGGGTTTTTGTTGGTTGTTGTTGTTGTTCGTTATGTTATTTATCGTAGTTCGTTCGGTGAAGTTCGTTGTTTTTTTTATTTTTTTAAGTGATTGTTAAACGTTTATCGGTTGGAATTGTTTTGGTAAGTTTAGAATTTTCGTTTTCGATTTTTTAATTTCGTAGAAGAATACGCGTATTTAGTATAGATTAGTTTATTTTAGCGCGTTTTTTTAGTTTTTTATTTTTTATTGTTTTAGATTTTTAATATTATTTATTTTTATTTAGAGAAATAAGGGGAATTGTTGTAGGTTCGGGGGTGAGGGGTGGTTTTGGGATGGGTAGAAAGTGTAGGTGTAGTAGGAAATTTTTGTATGTTTGCGTTTATATTGGAGTTGCGAGGATTTTGAGAAATATTAAACGGGATGGTTTTTTGGGTTTATTGTTTTGAAAGAGTATTAATTTTAGGGGAAATATTGAAATAGAAGTTTTGTTATTATTAAAGAAAAAAGTTTTATTAGGATGAGGAAGAAATAATTTTATGAGAAAGAATGAGCGAGAAAG。 4.根据权利要求1所述的TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤一中，引物对如下： 引物TMEFF2-F1的正向序列为ATTCGCGGCGTATGTAGAGG； 引物TMEFF2-F2的正向序列为GTTACGGGTTGGAGAGGAGC； 引物TMEFF2-F3的正向序列为AAACGTTAGAGGGATGCGGG； 引物TMEFF2-F4的正向序列为GAAGAGGGGCGTTAGTTC； 引物TMEFF2-F5的正向序列为GAGGGATTTAAATTTGCGAAC； 引物TMEFF2-R1的反向序列为CTACTAACGACCGACGCTCC； 引物TMEFF2-R2的反向序列为GTAACCCCGAACCGCGAATA； 引物TMEFF2-R3的反向序列为CACCCCCGAACCTACAACAA； 引物TMEFF2-R4的反向序列为GCCCGCATCCCTCTAAC； 引物TMEFF2-R5的反向序列为GTCCTACTAACGACCGACG。 5.根据权利要求1所述的TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤五2)中，反应材料及其体积如下：12.5μL的2x EpiArt HS Taq Master mix；2μL的引物；9.5μL的无核酸酶水；1μL的转化后的DNA模版。 6.根据权利要求1所述的TMEFF2基因启动子甲基化检测方法，其特征在于：所述步骤五2)中，PCR扩增程序如下：