PAL变体、包含该PAL变体的药物组合物以及用于制备该PAL变体的方法
本发明提供一种苯丙氨酸解氨酶(PAL)的变体，该苯丙氨酸解氨酶(PAL)来源于变异鱼腥藻并包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其中，所述变体包含氨基酸取代C503S/C565L，使得所述变体包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或氨基酸取代C503S/C565P，使得所述变体包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或氨基酸取代C503L/C565P，使得所述变体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。本发明还提供一种包括该变体的缀合物和药物组合物、用于编码该变体的多核苷酸，包括该变体的细菌以及用于制备该变体的方法。
发明专利
CN202210839871.7
2022-07-18
CN117417925A
2024-01-19
C12N9/88(2006.01)
浙江泽科塔生物医药有限公司
袁哲凡;郑华宝;魏冉;唐扬洋;金城东
311217 浙江省杭州市萧山区经济技术开发区建设二路666号信息港六期3幢3层301-2室
北京方迪誉诚专利代理有限公司
宣力伟%赵梦雯
浙江;33
1.一种苯丙氨酸解氨酶(PAL)的变体，该苯丙氨酸解氨酶(PAL)来源于变异鱼腥藻并包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述变体包含： 氨基酸取代C503S/C565L，使得所述变体包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或 氨基酸取代C503S/C565P，使得所述变体包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；或 氨基酸取代C503L/C565P，使得所述变体包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。 2.根据权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其特征在于，所述变体另外包含以下一个或多个氨基酸取代点突变：T102R、T102H、I165L、I165V、G166A、G166S、G218A、G218S、G218N、M222L、M222I、N437S、S438N、S438A、I439V、I439C、I439A、I439K、A440T、A440G、A440V、A440T、R441N、R442Q、T445V、T445S、A447S、E448K、N453G、Q457L和G458K。 3.根据权利要求1所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其特征在于，所述变体包含： 氨基酸取代C503L/C565P/222L，或氨基酸取代C503L/C565P/G218A。 4.根据权利要求1或2所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其特征在于，在苯丙氨酸转化为反式肉桂酸的反应中，所述变体的活性高于包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶。 5.根据权利要求1或2所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其特征在于，所述变体与包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶相比，在37℃至70℃范围内的温度下表现出相同的稳定性或更高的稳定性。 6.根据权利要求1或2所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其特征在于，所述变体与包含SEQID NO:1所示的氨基酸序列的苯丙氨酸解氨酶相比具有低聚集性。 7.一种缀合物，其特征在于，该缀合物包括根据权利要求1或2所述的苯丙氨酸解氨酶的变体和聚合物，其中该聚合物为水溶性聚合物。 8.根据权利要求7所述的缀合物，其特征在于，所述水溶性聚合物为聚乙二醇、聚两性离子聚合物和聚唑啉中的任意一种或两种以上的混合物。 9.一种药物组合物，包括： (i)根据权利要求1或2所述的苯丙氨酸解氨酶的变体或根据权利要求6所述的缀合物；和 (ii)合适的药学上可接受的载体，该载体为选自Tris-HCl、NaCl、L-苯丙氨酸(L-Phe)、甘氨酸(Gly)和反式肉桂酸中的任意一种或两种以上的混合物。 10.根据权利要求9所述药物组合物，其特征在于，所述药物组合物可以用于治疗苯丙酮尿症。 11.用于编码根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是DNA或RNA。 12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，其中所述多核苷酸被密码子优化，使得所述多核苷酸可用于在大肠杆菌中表达苯丙氨酸解氨酶的变体。 13.根据权利要求11所述的多核苷酸，其特征在于，其中所述多核苷酸被密码子优化，使得所述多核苷酸可用于在动物细胞，尤其人细胞中表达苯丙氨酸解氨酶的变体。 14.一种表达载体，其特征在于，该表达载体包含根据权利要求11至13中任一项所述的多核苷酸，其中，所述表达载体可以在活细胞中表达。 15.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是病毒，所述病毒包括腺病毒，腺相关病毒以及慢病毒。 16.根据权利要求14所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是质粒，该质粒包含启动子，并且该启动子与根据权利要求11至13中任一项所述的多核苷酸可操作地连接。 17.根据权利要求16所述的表达载体，其特征在于，所述质粒通过脂质体或阳离子聚合物转染进入细胞。 18.一种细菌，其特征在于，所述细菌在基因组上整合有根据权利要求11所述的多核苷酸和/或能够表达根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体。 19.一种修饰细胞，包括： 根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体； 根据权利要求11至13中任一项所述的多核苷酸； 根据权利要求14至17中任一项所述的表达载体；和 任选地，所述修饰细胞是修饰的动物细胞。 20.根据权利要求19所述的修饰细胞，其特征在于，所述修饰细胞是人细胞。 21.一种用于制备苯丙氨酸解氨酶的变体的方法，其特征在于，该方法包括在培养基中培养根据权利要求18所述的细菌或根据权利要求19所述的修饰细胞以产生苯丙氨酸解氨酶的变体并从所述修饰细胞和/或所述培养基中分离所述苯丙氨酸解氨酶的变体。 22.根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体在制备用于治疗个体苯丙氨酸水平升高的药物中的用途。 23.根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体在制备用于治疗苯丙酮尿症的药物中的用途。 24.一种在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述疾病或病症的特征在于苯丙氨酸的水平升高，其特征在于，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体；根据权利要求7或8所述的缀合物；根据权利要求9或10所述的药物组合物或根据权利要求11至13中任一项所述的多核苷酸；根据权利要求14至17中任一项所述的表达载体；根据权利要求18所述的细菌，和/或根据权利要求19或20所述的修饰细胞。 25.根据权利要求24所述的方法，其中对所述受试者皮下施用权利要求1至6中任一项所述的变体或权利要求7或8所述的缀合物。 26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述疾病或病症是苯丙酮尿症。 27.根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其中所述变体可表达在植物、真菌和细菌中。 28.根据权利要求1至6中任一项所述的苯丙氨酸解氨酶的变体，其中所述变体可表达在点状念珠藻、变异鱼腥藻、圆红冬孢酵母、海洋链霉菌、巢状倒囊藻、发光光杆状菌、轮丝链霉菌、大肠杆菌中。