SVA、O型FMDV和A型FMDV的一步法三重实时荧光定量PCR检测引物和探针
本发明提供了能同时检测鉴别塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的一步法三重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物检测技术领域。其中基于提供的引物和探针开发了试剂盒用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行同时快速检测。本发明的试剂盒和检测方法可实现一次上样、一次分析定量，达到同时快速检测鉴别和准确定量塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的目的，不仅减少了检测的工作量和成本，且能在最短的时间内完成检测。本发明将在塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的检测和疫苗生产中发挥重要作用，应用前景广阔。
发明专利
CN201910649503.4
2019-07-18
CN110305986A
2019-10-08
C12Q1/70(2006.01)
金宇保灵生物药品有限公司
陈君彦;王秀明;魏学峰;刘国英;关平原;王艳杰;刘建奇;武瑾贤;谢雪岑;陈九连
010030 内蒙古自治区呼和浩特市鄂尔多斯西街58号
北京尚诚知识产权代理有限公司
鲁兵
内蒙古;15
1.用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行三重实时荧光定量PCR检测的引物和Taqman探针，其特征在于，包括： 用于检测塞内卡病毒的上游引物(SVA-F)和下游引物(SVA-R)，所述上游引物(SVA-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：1所示，下游引物(SVA-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示； 用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA-P)，所述TaqMan探针(SVA-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：3所示； 用于检测O型口蹄疫病毒的上游引物(FMDV-O-F)和下游引物(FMDV-O-R)，所述上游引物(FMDV-O-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：5所示，下游引物(FMDV-O-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：6所示； 用于对O型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-O-P)，所述TaqMan探针(FMDV-O-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：7所示； 用于检测A型口蹄疫病毒的上游引物(FMDV-A-F)和(FMDV-A-R)，所述上游引物(FMDV-A-F)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：9所示，下游引物(FMDV-A-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：10所示； 用于对A型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-A-P)，所述TaqMan探针(FMDV-A-P)的核苷酸序列如序列表中SED ID NO：11所示； 所述探针为经过荧光标记的，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；且对三种病毒检测探针所标记的荧光报告基团不相同。 2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于： 用于对塞内卡病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(SVA-P)的5’端荧光报告基团为HEX，3’端荧光淬灭基团为BHQ1； 用于对O型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-O-P)的5’端荧光报告基团为FAM，3’端荧光淬灭基团为TAMRA； 用于对A型口蹄疫病毒进行实时荧光定量PCR检测的TaqMan探针(FMDV-A-P)的5’端荧光报告基团为ROX，3’端荧光淬灭基团为BHQ2； 所述探针的3’端已经磷酸化处理。 3.用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测的试剂盒，其特征在于： 包括权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针； 使用所述试剂盒时的25μL实时荧光定量PCR检测体系中所述引物和TaqMan探针的用量优选为：SVA-F(10μM) 0.4μL，SVA-R(10μM) 0.4μL，SVA-P(10μM) 0.4μL，FMDV-O-F(10μM)0.5μL，FMDV-O-R(10μM) 0.5μL，FMDV–O-P(10μM) 0.5μL，FMDV-A-F(10μM) 0.25μL，FMDV-A-R(10μM) 0.25μL，FMDV–A-P(10μM) 0.25μL。 4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品为塞内卡病毒RNA、O型口蹄疫病毒RNA和A型口蹄疫病毒RNA，各阳性对照品为单一包装或混合包装，阴性对照品为不含塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的反应体系，如H2O(双蒸水、无菌去离子水等)； 使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的阳性对照品混合或直接使用混合包装的阳性对照品。 5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中还包括标准品，其为分别携带塞内卡病毒核苷酸检测基因、O型口蹄疫病毒核苷酸检测基因和A型口蹄疫病毒核苷酸检测基因的重组质粒pCR-4 TOPO-SVA、pCR-4 TOPO-O-FMDV和pCR-4 TOPO-A-FMDV；各标准品为单一包装或等浓度混合包装； 使用所述试剂盒对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行一步法三重实时荧光定量PCR检测时，将单一包装的各标准品等浓度混合或直接使用混合包装的标准品。 6.权利要求3或4或5所述的试剂盒在对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行非疾病诊断目的的一步法检测中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于： 用于对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒进行定性、定量检测，包括以下步骤： 1)建立标准曲线：将分别携带塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒的检测基因的重组质粒pCR4-TOPO-SVA、pCR4-TOPO-O-FMDV和pCR4-TOPO-A-FMDV的单一包装的标准品等浓度混合或直接使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中的各标准品浓度稀释至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL，以不同浓度的标准品混合液作为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线； 2)提取待测样品的基因组RNA，以提取的基因组RNA为模板，在权利要求1或2所述的引物和TaqMan探针的引导下进行三重实时荧光定量PCR检测； 3)用得到的各自的CT值或荧光信号的变化实现对塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒定性检测； 4)对步骤3)中确定为某病毒阳性的待测样品，再根据该病毒的荧光信号的强度和步骤1)中的相应标准曲线，得出该样品中所含的该病毒的拷贝数，实现定量检测。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于： 所述步骤2)中的待测样品包括用于疫苗生产的原材料、半成品及成品、猪场送检样品。 9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于： 所述步骤1)和步骤2)中的25μL实时荧光定量PCR检测体系包括：模板2μL，实时荧光定量一步法PCR反应液2×One Step RT-PCR Buffer III 12.5μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.5μL，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.5μL，SVA-F(10μM) 0.4μL，SVA-R(10μM) 0.4μL，SVA-P(10μM) 0.4μL，FMDV-O-F(10μM) 0.5μL，FMDV-O-R(10μM) 0.5μL，FMDV–O-P(10μM) 0.5μL，FMDV-A-F(10μM) 0.25μL，FMDV-A-R(10μM) 0.25μL，FMDV–A-P(10μM) 0.25μL，RNA-freeH2O 6.05μL； 所述步骤1)和步骤2)中的三重实时荧光定量PCR检测条件为：先42℃反转录20min，95℃预变性3min；然后94℃变性15s，55℃退火30s，45个循环(PCR扩增)。 10.根据权利要求7-9任一所述的应用，其特征在于： 所述步骤3)中的判定方法为： 若样品在FMDV-O-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在FMDV–A-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在SVA-P的5’端所标记的荧光报告基团所对应的通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，判定为可疑，需重检； 优选地，若样品在FAM通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为O型口蹄疫病毒阳性(样品中含有O型口蹄疫病毒)；若样品在ROX通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为A型口蹄疫病毒阳性(样品中含有A型口蹄疫病毒)；若样品在HEX通道在37个循环内(不包括第37个循环)出现“S”型扩增曲线，则确认为塞内卡病毒阳性(样品中含有塞内卡病毒)；若样品在任一通道在39个循环以上(包括第39个循环)未出现“S”型扩增曲线，则确认为对应病毒阴性(样品中不含有塞内卡病毒、O型口蹄疫病毒和/或A型口蹄疫病毒)；若样品在任一通道在37-39个循环之间(包括第37个循环且不包括第39个循环)出现“S”型扩增曲线，则判定为可疑，需重检。