一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法

摘要：

本发明公开一种一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法。该方法利用RT‑ddPCR，结合用于RT‑qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行反应，实现GII型诺如病毒的高灵敏快速检测。本方法灵敏度高，可达约2copies/μL，而常规的RT‑qPCR的灵敏度通常为10copies/μL左右；扩增效率高，扩增效率为95.4％，R²＝0.9973。在低拷贝数下比RT‑qPCR更能有效规避果蔬中抑制物的影响，减少了假阴性的产生。因此，本发明检测方法灵敏、准确、直观，对农业部、检验检疫局等政府部门以及相关检测机构和企业提供了新的检测方法并具有指导意义。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201710630764.2

申请日期：2017-07-28

公开/公告号：CN107338328A

公开/公告日：2017-11-10

主分类号：C12Q1/70(2006.01)I

申请/专利权人:暨南大学

发明/设计人:吴希阳;陈嘉茵;李晖;魏霜

主申请人地址:510632 广东省广州市黄埔大道西601号

专利代理机构:广州市华学知识产权代理有限公司 44245

代理人:崔红丽%陈燕娴

国别省市代码:广东;44

权利要求：

一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)对果蔬样品中病毒进行洗脱，得到洗脱悬浮液，然后加入氯仿/正丁醇溶液，混合，室温静置，离心，收集上层水相；(2)以步骤(1)得到的上层水相进行病毒RNA提取，得到病毒RNA样品；(3)利用RT‑ddPCR，结合用于实时荧光定量RT‑qPCR检测GII型诺如病毒的引物和探针，进行扩增反应，建立一步法RT‑ddPCR高灵敏快速检测GII型诺如病毒的方法；步骤(3)中所述的引物和探针：上游引物QNIF2：5′‑ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA‑3′；下游引物COG2R：5′‑TCGACGCCATCTTCATTCACA‑3′；探针QNIFs：5′‑FAM‑AGCACGTGGGAGGGCGATCG‑BHQ1‑3′；步骤(3)中所述的RT‑ddPCR的反应体系为：<img file="FDA0001363792890000011.TIF" wi="1110" he="711" />所述的RT‑ddPCR的反应条件为：逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃±2℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。