一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法

摘要：

本发明涉及一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，首先将视网膜色素上皮细胞进行培养液的清除并进行洗涤，然后将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40??50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple??select溶液按体积比为1:2??3混合制成消化液进行消化分离，最后经过计数、离心后进行冻存。本发明分离方法简单，步骤易于控制，采用DispaseⅡ分离酶和Tryple??select溶液混合制成消化液对视网膜色素上皮细胞进行消化分离，能够缩短视网膜色素上皮细胞解除贴壁的时间，同时保持细胞的完整性，对细胞的损伤大大降低。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201611081885.8

申请日期：2016-11-30

公开/公告号：CN106434531A

公开/公告日：2017-02-22

主分类号：C12N5/071(2010.01)I

申请/专利权人:江苏艾尔康生物医药科技有限公司

发明/设计人:谢磊;李宁;范国平;方攀峰;秦承学;陆梦华

主申请人地址:214028 江苏省无锡市新区长江路34号地块科技创业园一区502号

专利代理机构:无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104

代理人:曹祖良%任月娜

国别省市代码:江苏;32

权利要求：

一种人类视网膜色素上皮细胞的分离、冻存方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）清除培养液：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，吸去培养液；（2）洗涤：向培养瓶内加入DPBS（CTS）缓冲液5~10ml，轻轻摇匀，完全洗涤后移除液体；（3）消化：将DispaseⅡ分离酶和DPBS缓冲液按1:40??50w/v混合，制成DispaseⅡ分离酶溶液，DispaseⅡ分离酶溶液和Tryple??select溶液按体积比为1:2??3混合制成消化液，向步骤（2）中的培养瓶中加入消化液2~3ml，充分混匀后放入二氧化碳培养箱中继续培养10~15min；（4）准备：在离心管中加入视网膜色素上皮细胞培养基3~5ml备用；（5）终止：将视网膜色素上皮细胞从二氧化碳培养箱中取出，加入2~3ml视网膜色素上皮细胞培养基终止反应，吹打细胞，将视网膜色素上皮细胞收集至准备好的离心管中；（6）计数：将视网膜色素上皮细胞混匀后取50~100ul细胞悬液进行细胞活率计数；（7）离心：将收集好的视网膜色素上皮以1800~2200??rpm/min离心，离心时间为5~10min；（8）冻存：离心结束后弃去上清，根据细胞计数结果加入冻存液Cryo??SFM，调整细胞密度为1×10⁶/ml，分装至冻存管中进行冻存。