BMP-2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞及其制备方法
本发明涉及骨组织工程技术领域，尤其涉及一种BMP-2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，该方法包括以下的步骤：1）MSCs的原代分离培养；2）MSCs的纯化；3）MSCs的传代培养；4）构建携带huVEGF165和huBMP-2的慢病毒载体；5）huVEGF165和huBMP-2双基因修饰骨髓间充质干细胞。本发明选择BMP-2/VEGF165双基因修饰BMSCs，达到较为长期、高效的效果，避免了直接应用生长因子时可能发生的过量反应和全身性毒副作用。采用这一策略，不仅可以获取具有旺盛生理功能的种子细胞，而且利用腺病毒载体还能使种子细胞大量表达需要的目的蛋白利于组织构建。
发明专利
CN201410438098.9
2014-08-29
CN104250655A
2014-12-31
C12N15/867(2006.01)I
杭州市萧山区中医院
全仁夫;张亮;许世超
311200 浙江省杭州市萧山区育才路152号
杭州丰禾专利事务所有限公司 33214
王从友
浙江;33
BMP‑2/VEGF165双基因修饰的骨髓间充质干细胞的制备方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）MSCs的原代分离培养选用实验兔骨髓液3‑4mL，将骨髓液加入缓慢注入预先加入4mL淋巴细胞分层液的试管内,密度梯度离心,2500r/min离心30min, 离心后吸取中间的单个核细胞层，PBS洗1次，以3×10<sup>5</sup>/cm<sup>2</sup>的密度接种于25cm<sup>2</sup>培养瓶内，加15%胎牛血清DMEM培养液3mL在5%CO<sub>2</sub>孵箱内37℃培养；3‑5天后半量换液；继续培养且全量每周换液2次；2）MSCs的纯化用CD14<sup>‑</sup>和CD105<sup>+</sup>双标分选纯化BMSCs； 3）MSCs的传代培养 用0.25%胰酶消化5min,即得到原代MSC<sub>S</sub>悬液, 再以1×10<sup>4</sup>/cm<sup>2</sup>的密度传代培养；4）构建携带 huVEGF165和 huBMP‑2的慢病毒载体①用酶切法和测序法鉴定了 pUC18‑huVEGF165和pUC18‑huBMP‑2，保证了外源基因序列的正确性；②回收huVEGF165、huBMP‑2的目的基因，将目的基因与载体pEASY‑T1按3:1的摩尔浓度比例在37℃连接15min；③对huVEGF165、huBMP‑2与pEASY‑T1连接产物进行检测；5）huVEGF165和huBMP‑2双基因修饰骨髓间充质干细胞取第3代兔子骨髓间充质干细胞MSCs，转染前24 h细胞以5×10<sup>5</sup>/孔密度接种于6孔培养板，无抗生素培养基培养，待细胞达到80%融合时准备转染；分别将粗制的Ad‑huVEGF165、Ad‑huVEGF165‑eGFP 液和Ad‑huBMP‑2、Ad‑huBMP‑2‑eGFP用无血清培养基稀释，使病毒滴度为 1～3×10<sup>8</sup>pfu/ml，按 50～150pfu／细胞将病毒液加入未经消化的培养瓶，37℃、5%CO<sub>2</sub>、饱和湿度孵箱内孵育 1hr，每 10min 摇晃培养板，使病毒液均匀覆盖细胞；孵育结束后，吸除病毒液和无血清培养基，加入含血清的细胞培养液 6ml 继续培养1~2天，获得huVEGF165和huBMP‑2双基因修饰骨髓间充质干细胞。