一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法
本发明公开了一种促进精氨酸脱亚氨基酶(ADI)高效水溶性表达的方法。是将来源于恶臭假单胞杆菌的ADI基因连接pET-30a-c(+)载体,构建重组表达质粒pET30a-ADI,并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中,获得含双质粒的工程菌;将工程菌接种于含有1-10g/L D-葡萄糖的LB培养基中,并添加L-阿拉伯糖培养;当菌体培养至对数期时,再添加1-10g/L的L-精氨酸及0.1mM IPTG,在16℃,180rpm条件下诱导培养实现。本发明方法可显著提高重组ADI蛋白的水溶性产量,粗酶液活性也提高了15倍,并有效克服了重组ADI难以可溶性表达的缺陷,为工业化大规模生产瓜氨酸等应用提供了技术支持,也为其他重组蛋白的表达提供了一个新思路。
发明专利
CN201310473752.5
2013-10-11
CN103468664A
2013-12-25
C12N9/78(2006.01)I
山东大学
李越中;王颖
250061 山东省济南市历城区山大南路27号
济南圣达知识产权代理有限公司 37221
李健康
山东;37
一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法,步骤是:(1)将来源于恶臭假单胞杆菌(Pseudomonas putida)的精氨酸脱亚氨基酶(Argininedeiminase,ADI)基因连接至pET‑30a‑c(+)载体,构建重组表达质粒pET30a‑ADI,并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中,获得含双质粒的工程菌;(2)将步骤(1)所述的含双质粒工程菌接种于LB培养基中,在37±1℃,200±10rpm条件下培养12‑18h;(3)在LB培养基中添加1‑10g/L的D‑葡萄糖制得LBG培养基,将步骤(2)培养后的菌液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基中,再添加终浓度为0.2‑0.8g/L的L‑阿拉伯糖,在37±1℃,200±10rpm条件下培养;(4)当步骤(3)所述菌体培养至OD600=0.6‑0.8时,向培养液中添加终浓度为1‑10g/L的L‑精氨酸,和终浓度为0.1mM的IPTG,在16±1℃,180±10rpm条件下诱导培养24‑30h;(5)将步骤(4)培养后的菌液在4℃,8000rpm条件下离心10‑15min,弃上清,沉淀用体积比为10%的Tris‑NaCl缓冲液重悬,常规超声破碎,之后在4℃,12000rpm条件下离心30‑35min,分离出可溶性组分与不溶组分,可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。