一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法
本发明提供的一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法，收集胎羊，利用Trizol法提取腹部组织总RNA，将总RNA反转录成cDNA;设计引物，并在两端添加酶切位点及His标签序列：上游引物P1:5’-GTCCGGATCCACTTCATGTACGTGGCCGTGGTGG-3’，下游引物P2:5’-CCTGACGCGTTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGAATGCCTCCGGGACGTG-3’；用cDNA为模板进行PCR扩增NICD片段；PCR产物经过BamHI和MluI双酶切;回收产物与pLex-mcs慢病毒表达载体进行连接，进行克隆并利用脂质体转染入293T细胞中，通过western blot检测NICD的表达，验证克隆序列的正确性。
发明专利
CN201310323111.1
2013-07-29
CN103409429A
2013-11-27
C12N15/12(2006.01)I
新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心
刘晨曦;刘明军;李文蓉;陈红玲;唐森
831300 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市克拉玛依东街151号
乌鲁木齐新科联专利代理事务所(有限公司) 65107
欧咏
新疆;65
一种克隆绵羊Notch1基因胞内结构域NICD的方法，其特征在于：分步实施；1）从屠宰场收集刚死亡1月龄胎羊，冻存于液氮中，利用Trizol法提取腹部组织总RNA，将总RNA反转录成cDNA;2)设计引物：用人的NICD结构域5’起始端和3’终止端序列BLAST，比对绵羊全基因组序列，依据比对结果，确定绵羊NICD在基因组上5’和3’端位置，设计特异性引物，并在两端添加酶切位点及His标签序列：上游引物P1: 5'‑GTCCGGATCCACTTCATGTACGTGGCCGTGGTGG‑3’，下游引物P2: 5’‑CCTGACGCGTTTAGTGATGGTGATGGTGATGCTTGAATGCCTCCGGGACGTG‑3’；3）用cDNA为模板进行PCR扩增NICD片段；PCR扩增体系：2.5U/μL PrimerStar DNA Polymerse 5μL，5×PS buffer 5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10pmol/μL上下游引物各0.5μL，cDNA模板4μL，ddH2O补至25μL；反应程序：预变性98℃，4min；变性98℃，10sec；退火60℃，15sec；延伸72℃，3min 35个循环；72℃，10min;4）PCR 产物经过BamHI和MluI双酶切，后进行胶回收纯化；5）回收产物与pLex‑mcs慢病毒表达载体进行连接，转化DH5α感受态细胞，进行克隆;6）将克隆好的绵羊NICD慢病毒表达载体，利用脂质体转染入293T细胞中，通过western blot检测NICD的表达，验证克隆序列的正确性。