一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法
本发明公开了一种β-胡萝卜素降解酶的纯化方法,首先在改良查氏培养基中培养产β-胡萝卜素降解酶的葡萄球菌,培养24h,10000r min-1离心20min取上清得到粗酶液,然后采用冷冻干燥将粗酶液浓缩,用于纯化。该方法采用蛋白纯化系统(AKTA purifier100system)和高效制备液相(PHPLC)相结合的方式纯化β-胡萝卜素降解酶,并通过HPLC检测酶纯度,能快速的纯化得到纯度达95%的纯酶。该发明前处理较为简单易行,纯化过程稳定,重复性高,可得到大量纯酶,为其在工业上用于降解β-胡萝卜素产香奠定基础。
发明专利
CN201310309507.0
2013-07-22
CN103421751A
2013-12-04
C12N9/08(2006.01)I
西北农林科技大学
樊明涛;朱明明;王树林
712100 陕西省西安市杨凌示范区邰城路3号
西安恒泰知识产权代理事务所 61216
李郑建
陕西;61
一种β‑胡萝卜素降解酶的纯化方法,其特征在于,该方法采用蛋白纯化系统和高效液相色谱法对β‑胡萝卜素降解酶进行纯化,利用高效液相色谱法对其纯度进行鉴定,并算出该酶纯化每一步的酶活和比活力,具体按下列步骤操作:1)在改良查氏培养基中培养葡萄球菌,培养条件为:37℃,恒温培养24h;2)培养结束后,将发酵液于10000r min‑1冷冻离心20min,取上清得粗酶液,冷冻、干燥、浓缩粗酶液至规定的浓度,取浓缩液过0.22μm有机系滤膜,得上样:3)纯化:纯化分三步:第一步是离子交换,上样于蛋白纯化系统,条件:强阴离子柱MONO Q10/100GL,选择合适的缓冲液进行线性洗脱,选择三个波长同时检测,收集具有降解β‑胡萝卜素能力的活性成分;第二步,将上述得到的活性成分进高效液相色谱进行进一步分离,纯化条件:半制备色谱柱C18,选择合适柱温,以及合适流动相进行梯度洗脱,选择相应波长检测,将具有降解β‑胡萝卜素能力的活性峰收集,冷冻干燥浓缩;第三步,上样于蛋白纯化系统,条件:多肽分子筛Superdex peptide10/300column,选择合适的缓冲液洗脱,选择三个波长同时检测,收集目标峰,浓缩,重新上样于多肽分子筛,同样的条件再次纯化收集目标峰,浓缩进HPLC进行检测;采用分析液相检测纯度的条件:色谱柱C18,选择合适的柱温及其合适的流动相洗脱,选择相应的波长检测;将底物β‑胡萝卜素配制成胡萝卜素储备液,并建立β‑胡萝卜素溶液浓度与吸光值的标准曲线,用以计算β‑胡萝卜素降解酶的酶活和比活力。