DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变
本发明公开了DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变,包括提取样本、引物设计、PCR反应及DHPLC检测等步骤,其中目的片段长度为339bp,DHPLC检测柱温为59.5℃。本发明不仅能检测出突变型和野生型个体,还能准确检测到低水平或高水平的异质性突变个体,并能精确定量其突变负荷,从而可以较好地解释临床表型多样化的原因,有助于进一步研究线粒体耳聋的分子遗传学机制,本发明的最低检测水平可达到5%,灵敏度较高。
发明专利
CN201310302286.4
2013-07-18
CN103436604A
2013-12-11
C12Q1/68(2006.01)I
深圳市人民医院
王沙燕;沈姗姗;王琳凯
518020 广东省深圳市东门北路1017号
东莞市创益专利事务所 44249
李卫平
广东;44
DHPLC检测并定量线粒体DNA 1555A>G的异质性突变,其特征在于包括如下步骤:1)提取线粒体DNA样本;2)引物设计,根据DHPLC方法的原理及检测要求,应用在线引物设计工具进行引物设计;3)确定PCR反应体系及反应条件,采用优化好的引物及PCR体系对线粒体DNA 1555A>G进行PCR扩增,得到PCR反应的产物;4)用DHPLC方法对PCR反应的产物进行异质性突变的检测:将PCR反应的产物在PCR仪中95℃变性5min,然后以1℃/min的速度缓慢降温至25℃,以充分形成异源性DNA双链; 然后采用DHPLC分析仪分析,每次自动进样8μL,采用流动相A液(0.1mmol/L TEAA,0.025%乙腈)和B液(0.1mmol/L TEAA,25%乙腈)将前述样本从分离柱中洗脱,检测柱温为59.5℃,洗脱液流速为0.9mL/min,洗脱曲线由紫外检测器检测获得,紫外检测器在260nm波长处收集信号。