一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法
本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，属于生物工程技术领域。以产生广谱高效抗菌肽的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BRT39为生产菌株，通过液体种子制备、发酵液制备、发酵液预处理、抗菌肽提取与精制、抗菌肽干粉制备等工艺方法制备高纯抗菌肽成品，活力回收率达到43.5％以上。本发明工艺简单，抗菌肽产量高、纯度高，所制的抗菌肽干粉属于天然抗菌剂，无毒副作用，可以用作食品防腐剂、饲料添加剂、农用生物防治剂和动物防病剂，具有无毒、无残留、不产生耐药性、安全性高的优点。
发明专利
CN201310225319.X
2013-06-06
CN103333937A
2013-10-02
C12P21/00(2006.01)I
徐州工程学院
高兆建;樊陈;鞠民友;孙会刚;侯进慧;李同祥;杜永凯;纪伟
221000 江苏省徐州市新城区富春路1号徐州工程学院
南京经纬专利商标代理有限公司 32200
李纪昌
江苏;32
一种利用枯草芽孢杆菌制备抗菌肽的工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：1)菌株活化将保藏完好的斜面菌种CGMCC NO.5702接种于斜面培养基，35‑37℃培养16‑20h，进行菌种活化；2)液体种子培养将活化好的枯草芽孢杆菌斜面菌种接入灭菌后的种子培养基中，于旋转摇床180‑200r/min、35‑37℃恒温振荡培养16‑20h，种子发酵液的含菌量为107‑108cfu/mL；3)摇瓶发酵培养将步骤2)得到的种子液以4‑10％的接种量接入三角瓶，1000mL三角瓶装摇瓶发酵培养基为100‑200mL，三角瓶塞采用乳胶塞，发酵温度32‑37℃，转速160‑200r/min摇床培养60‑62h；4)15升气式自动发酵罐发酵培养采用分批补料发酵方式进行气升式液体深层发酵：15L发酵罐装发酵培养基10L，发酵罐灭菌冷却后，将步骤3)中的摇瓶发酵液按照4‑6％接种量接种，发酵控制条件为：温度35‑37℃，时间60‑62h，发酵培养基pH值7.5‑8.0，无菌空气通风比1∶1(v/v)，罐压0.02MPa，发酵15‑20h后，每隔6‑8h向发酵液中补加葡萄糖溶液100mL；5)发酵液预处理将步骤4)发酵液10000‑12000r/min离心8‑10min去菌体，得到发酵液上清。取上清液首先通过截留分子量为20kDa的超滤膜超滤，收集的滤液再经过截留分子量为1000Da的超滤膜超滤，弃去滤过液，抗菌肽溶液浓缩10倍。将超滤得到的浓缩抗菌肽溶液加热升温至82‑85℃，保温12‑15min后将温度降至32‑35℃，继续降温至4℃静置4‑6h，10000‑12000r/min离心8‑10min去掉加热变性的絮状悬浮沉淀蛋白。室温下向以上离心过后的发酵清液中慢慢加入固体硫酸铵至20％饱和度，冰箱中静置4‑6h后，1000‑12000rmp离心8‑10min，收集上清液，再向收集的上清液中加入固体硫酸铵至饱和度80％，4℃静置4‑6h，1000‑12000r/min离心8‑10min，收集沉淀并溶解于0.02mol/L，pH7.0的Tris‑HCl缓冲液中，进一步采用透析袋透析，其间每隔3～4h，更换一次纯水，得透析完全的抗菌肽样品；6)抗菌肽阴离子交换层析将步骤5)透析完全的抗菌肽样品上样DEAE‑Sepharose FF阴离子交换柱。采用0.02mol/L pH值8.0的Tris‑HCl缓冲溶液将未结合的杂质洗脱掉，一直洗脱至紫外检测线不发生变化，再用含有0‑1mol/L的NaCl的0.02mol/L pH值8.0的Tris‑HCl的缓冲溶液进行线性梯度洗脱，洗脱速度1.5ml/min，按每管3ml收集，抗菌肽洗脱出的NaCl浓度为0.50‑0.55mol/L。合并有抗菌活性的收集管，采用截留分子量为1000Da的纤维素膜超滤浓缩后得阴离子交换层析活性浓缩液；7)抗菌肽分子筛凝胶柱过滤层析将步骤6)阴离子交换层析活性浓缩液上样Sephadex G‑15分子筛凝胶柱，洗脱缓冲溶液为0.02mol/L、pH值8.0的Tris‑HCl，洗脱速度1mL/min，按每管2mL收集，合并有活性的收集管得分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液；8)高纯度抗菌肽干粉制备将步骤7)分子筛凝胶柱过滤层析抗菌肽活性溶液采用截留分子量1000Da的超滤膜过滤，使抗菌肽溶液浓缩15倍。然后采用旋转蒸发仪真空浓缩，温度为65‑75℃，当浓缩至抗菌肽溶液较为粘稠时，取出抗菌肽浓缩液于‑20℃冷冻8‑10h，然后将结冰的抗菌肽置于真空冷冻干燥机中，控制真空度为30‑50Pa，温度为‑35℃，干燥时间15‑18h，即得抗菌肽成品。