一种RNA的免洗涤预备模板PCR检测方法
本发明提供了一种RNA的免洗涤预备模板PCR检测方法，本发明方法在保留了原预备模板PCR方法的优点，即不需要纯化抽提RNA，不需要进行逆转录反应等优点的基础上，通过整合酶切反应，达到排除各种来源的双链DNA污染的干扰，因此不需要进行洗涤步骤，操作更加简便快速易行，具有良好的RNA检测的灵敏度和特异性，适合对各种来源的样品进行检测。
发明专利
CN201310205271.6
2013-05-28
CN103333954A
2013-10-02
C12Q1/68(2006.01)I
浙江今复康生物科技有限公司
陈燃;金晓铮
310052 浙江省杭州市滨江区滨安路688号天和科技园
杭州天正专利事务所有限公司 33201
黄美娟%冷红梅
浙江;33
一种RNA的免洗涤预备模板PCR检测方法，所述方法包括：（1）设计合成与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25～50mer的单链寡核苷酸DNA，记为探针A；探针A的GC含量为40～60%，解链温度为75～85℃；将探针A锚定在PCR管内，得到锚定PCR管；（2）设计合成部分序列与目标RNA上另一段含有限制性内切酶识别位点的序列互补的长度为70～100mer的单链寡核苷酸DNA，其结构为:中间长度为25～50mer与目标RNA上含有限制性内切酶识别位点的区域完全互补的序列，两端为长度20～30mer的PCR引物序列，记为模板探针B；模板探针B的GC含量为40～60%，解链温度为75～85℃，与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠；（3）设计合成长度为15～30mer的单链寡核苷酸DNA，记为互补探针C；该探针与前述模板探针B上含有限制性内切酶位点的区域的部分序列完全互补结合；其解链温度为50～60℃；（4）取待测样本，加入模板探针B、互补探针C和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，室温振荡10min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；（5）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，55～65℃保温10～30min，吸干管内液体，加入20uL由PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、PCR引物、SYBR green I或TaqMan探针，及前述的限制性内切酶所配制的RE/PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行荧光定量分析；PCR反应条件如下：37℃5～20min，92～95℃2～5min，然后35～40个循环的92～95℃3～30sec，55～66℃20～60sec；（6）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（4）和（5）方法进行处理和分析，以样本Ct值小于空白裂解液Ct值，且差的绝对值大于等于1，判断为阳性。