AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法
本发明公开了一种高新生物技术，尤其涉及一种AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法。本发明克隆的色氨酸基因簇在设计引物时，去掉了前导序列，使菌株丧失阻遏衰减系统，直接从TrpE基因开始设计上游引物，同时，为了可以和AroI基因串联表达，并用同一个启动子Tac，下游引物设计在TrpA的末端，使得核糖体可以顺利通过，启动AroI基因的表达，从而完成串联表达，提高各关键酶比酶活，提高色氨酸产量。
发明专利
CN201310130368.5
2013-04-10
CN104099365A
2014-10-15
C12N15/77(2006.01)I
吉林农业大学
刘俊梅;胡耀辉;李琢伟;王丹;王玉华;朴春红;于寒松;代伟长
吉林省长春市新城大街2888号
吉林;22
AroI基因及与色氨酸操纵子的串联表达方法，其特征在于：所述方法所使用的材料包括菌株、载体、培养基；所述菌株包括大肠杆菌BL21(DE3)及谷氨酸棒杆菌LG‑332；所述载体包括pMD18T‑simple‑Trp cluster载体、pZ8‑1(pZ8‑1 Shuttle expression vector，containing tac promoter，mcs，E.coli ori from pACYC177，C.glutamicum ori from pHM1519，Kmr)穿梭表达载体；所述培养基包括固体完全培养基(g/L)、斜面保藏培养基(g/L)、种子培养基(g/L)、发酵培养基(g/L)；该方法通过以下步骤实现：1)谷氨酸棒杆菌HYHI感受态制作：a、取谷氨酸棒杆菌HYHI单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600：0.3；b、将(1)中菌液按3％接入EPO(20ml水+2.5g甘油+0.1mlTween80+80mlLB)，在18℃恒温振荡器上以120r/min振荡培养28h；c、取出1～2ml菌液检测OD600是否达到1，当OD600为1时，将菌液冰浴10min；同时冰浴浓度为10％的甘油；d、取400g冰浴好的菌液，9600r/min离心10min。弃上清，将管倒置于滤纸上，使管内培养液流尽，以收集菌体；e、每管加入50ml 10％预冷甘油，轻轻吹打，重悬细菌，然后于4℃，4,000rpm离心10min，弃上清，此步骤重复四次；f、每管加入0.5ml 10％预冷甘油重悬细菌沉淀；g、分装至100μl离心管中于‑80℃保存备用；2)、DAHP合成酶基因及突变基因谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体的构建：a、DAHP合成酶基因及突变基因穿梭表达载体引物为：D1：GGTGGT<u>GGATCC</u>AAAGGAGGACAACCATGAGTTCTCCAGTCTCACTCG(下划线为BamHI酶切位点)；D2：AAA<u>CTGCAG</u>TTAC TTGGCTGCTGCTCGGCGTTCC(下划线为PstI酶切位点)；b、PCR扩增目的基因：以TE溶液稀释100倍的pMD18T‑simple‑Aro I/AroI*为模板，以D1、D2为引物PCR条件扩增ZAro I/ZAro I*(带有BamHI和PstI的PCR产物命名为ZAroI/ZAro I*)，回收目的基因片段，并连接、转化、阳性克隆筛选，阳性克隆命名为pMD18T‑simple‑ZAro I/ZAro I*；c、目的基因与表达载体pZ8‑1的酶切：限制性内切酶BamHI和PstI双酶切重组质粒pMD18T‑simple‑ZAro I和pMD18T‑simple‑ZAro I*，同时对pZ8‑1载体也于37℃恒温4h进行双酶切，分别按照下表中体系进行加样0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体的目的片段；<tables num="0001" id="ctbl0001"><img file="FSA00000879834400021.tif" wi="1775" he="983" /></tables>d、回收片段的连接：将回收的带有粘性末端的AroI和AroI*基因的ORF片段及载体片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系按下表成分用量连接过夜；<tables num="0002" id="ctbl0002"><img file="FSA00000879834400022.tif" wi="1461" he="607" /></tables><tables num="0003" id="ctbl0003"><img file="FSA00000879834400031.tif" wi="1496" he="369" /></tables>e、重组载体转化、鉴定：将重组载体转化，然后进行酶切与PCR鉴定，正确的重组质粒进行序列测定，测序验证正确的载体分别命名为pZ8‑1‑Aro I和pZ8‑1‑Aro I*，再电转入谷氨酸棒杆菌LG‑332感受态细胞中，其中阳性克隆的筛选标记抗生素为卡那霉素，筛选浓度为25mg/l，Aro I和Aro I*在谷氨酸棒杆菌LG‑332中的诱导表达、SDS‑PAGE电泳、表达产物生物学活性的测定和比较；3)、谷氨酸棒杆菌Trp Cluster与pZ8‑1‑Aro I和pZ8‑1‑Aro I*串连表达载体构建谷氨酸棒杆菌Trp Cluster与pZ8‑1‑Aro I和pZ8‑1‑Aro I*串连表达载体构建：a、pMD18T‑simple‑Trp cluster载体与表达载体pZ8‑1‑Aro I和pZ8‑1‑Aro I*的酶切：限制性内切酶BamHI单酶切重组质粒pMD18T‑simple‑Trp cluster和pZ8‑1‑Aro I和pZ8‑1‑Aro I*，于30℃恒温过夜进行单酶切，按下表体系进行加样，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收目的基因和载体目的片段；<tables num="0004" id="ctbl0004"><img file="FSA00000879834400032.tif" wi="1777" he="867" /></tables>b、载体去磷酸化：为防止单酶切载体的自连，按下表体系加样，50℃水浴1h，0.8％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳结果，回收去磷酸化的载体目的片段；<tables num="0005" id="ctbl0005"><img file="FSA00000879834400041.tif" wi="1357" he="960" /></tables>c、回收片段的连接：将回收的Trp cluster基因片段及载体片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系见下表，16℃连接过夜；<tables num="0006" id="ctbl0006"><img file="FSA00000879834400042.tif" wi="1401" he="863" /></tables>d、重组载体转化、鉴定：将重组载体转化，然后进行酶切与PCR鉴定，正确的重组质粒进行序列测定，测序验证正确的载体分别命名为pZ8‑1‑Trpcluster‑Aro I and pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I*，再电转入谷氨酸棒杆菌LG‑332中，其中阳性克隆的筛选标记抗生素为卡那霉素，筛选浓度为25mg/l；e、pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I和pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I*在E.coli中的诱导表达、SDS‑PAGE电泳；f、DAHP合成酶、邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶酶生物活性测定分析：诱导结束后，培养液于4℃离心收集菌体，用0.1mol/L pH7.8Tris‑HCl缓冲液洗涤2次，按1g湿菌悬于5ml缓冲液中的比例制备悬液，在冰浴条件下超声破碎处理，30×4s，200W，4℃10000r/min离心20min，上清即为粗酶液，用于酶活性测定，对邻氨基苯甲酸合成酶和色氨酸合成酶的活性进行初步测定；4)、色氨酸定量分析：L‑色氨酸含量测定，采用高效液相色谱法测定，色谱条件为C18分离柱(150mm×6.0mm Shimazu Co.Ltd.)；流动相，含15％甲醇的0.02mol/L NaAc缓冲溶液(pH＝4.5)；流动相流速，0.6mL/min；纸速，0.25cm/min；检测波长，UV280nm；外标法定量；5)、重组表达载体pZ8‑1‑Aro I/Aro I*的鉴定：分别挑取两组转化平板菌落，对其进行菌落PCR检测，均能扩增出约1.1Kb的特异条带，大小与预期相符，选取PCR检测阳性的菌落培养后抽提质粒以BamHI和PstI进行双酶切，均能切出一条约1.1Kb的条带，与预期结果相一致，将菌落PCR及双酶切检测均呈阳性的pZ8‑1‑Aro I/Aro I*质粒进行测序；6)、重组串联表达载体pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I/Aro I*的鉴定：分别挑取两组转化平板菌落，对其进行菌落PCR检测，均能扩增出约1.1Kb及7.1kb的特异条带，大小与预期相符，选取PCR检测阳性的菌落培养后抽提质粒以BamHI和PstI进行双酶切，均能切出一条约1.1Kb的条带，与预期结果相一致，且BamHI单酶切可切出7kb左右的片段，将菌落PCR及双酶切检测均呈阳性的pZ8‑1‑Trpcluster‑Aro I/Aro I*质粒进行测序；7)、重组质粒pZ8‑1‑Aro I/Aro I*的诱导表达：在谷氨酸棒杆菌中，经IPTG诱导，相对于未诱导菌株对照，经SDS‑PAGE分析表明pZ8‑1‑Aro I/Aro I*诱导后，明显表达约40KDa的特异蛋白，可溶性分析显示，融合蛋白以胞内可溶性形式存在，与预期的相对分子量基本相一致；8)、重组串联表达载体pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I/Aro I*的诱导表达：在谷氨酸棒杆菌中，经IPTG诱导，相对于未诱导重组质粒pZ8‑1‑Aro I/Aro I*对照，经SDS‑PAGE分析表明pZ8‑1‑Trp cluster‑Aro I/Aro I*诱导后，明显表达约40KDa的特异蛋白，可溶性分析显示，融合蛋白以胞内可溶性形式存在，与预期的相对分子量基本相一致，转化后的谷氨酸棒杆菌经IPTG诱导表达后，从SDS‑PAGE电泳结果看，在大约56KD、53KD、29KD处明显有条带加深，说Trp‑cluster基因簇获得了表达，大小与理论相符。