20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法
本发明公开了一种20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，属于医学亲缘关系鉴定技术领域。其包括下述步骤：（1）DNA溶液的制备；（2）扩增；（3）纯化扩增产物；（4）延伸反应；（5）纯化延伸产物；（6）检测、确定延伸产物。本发明使待测靶DNA的片段范围缩短至61～99bp，提高对高度降解DNA分型的成功率，能够解决亲祖关系、半同胞关系、同胞关系等复杂亲缘关系鉴定的难题。对复杂亲缘关系鉴定以及高度降解检材DNA的法医学分型方面具有很大的优势和潜力。
发明专利
CN201310125171.2
2013-04-12
CN103215360A
2013-07-24
C12Q1/68(2006.01)I
河北医科大学
丛斌;李淑瑾;王茜
050017 河北省石家庄市中山东路361号河北医科大学法医学系
石家庄国为知识产权事务所 13120
陆林生
河北;13
一种20个X?SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，其特征在于包括下述步骤：（1）DNA溶液的制备：提取DNA，制备DNA溶液；（2）扩增：在扩增体系中加入步骤（1）所得的DNA溶液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、30s,?58℃、30s，65℃、30s，进行35个循环；再在65℃保持7min；最终在4℃保存，获得扩增产物；所述扩增体系包括：PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq?DNA聚合酶、模板DNA；（3）纯化扩增产物：应用核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件：37℃、1h，然后80℃、15min，最终在4℃保存，得纯化后的扩增产物；（4）延伸反应：将纯化后的扩增产物加入至延伸反应试剂中进行延伸反应；延伸反应的条件：依次在96℃、10s，50℃、5s，60℃、30s进行25个循环，最终保存在4℃，得延伸产物；所述的延伸反应试剂为延伸引物和SNaPshot反应混合液；（5）纯化延伸产物：将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应：37℃、1h，80℃、15min，最终保存在4℃，得纯化后的延伸产物；（6）检测、确定延伸产物将步骤（5）中得到的纯化后的延伸产物中加入至测试试剂中，混匀；检测条件：15000V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定20个X?SNP位点的基因型；所述的测试试剂为Hi?Di甲酰胺和GeneScanTM?Size?Standards?120?LIZ；所述的PCR引物和延伸引物由20个X?SNP位点的引物组成，所述20个X?SNP位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs5916197，rs757018，rs2071182，rs5951622，rs4898214，rs5963947，rs5906341，rs4826645，rs3860291，rs5912774，rs1988916，rs5941046，rs4463614，rs5916844，rs6568051，rs2522169，rs5930646，rs5929739，rs5908051，rs6627351；所述20个X?SNP位点的PCR引物及延伸引物序列为：。673046dest_path_image002.jpg,590187dest_path_image004.jpg,307607dest_path_image006.jpg