一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法
一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，包括设计引物、牡丹基因组DNA的提取、牡丹基因组DNA酶切、接头的准备、酶切产物和接头的连接、连接产物的预扩增、选择性扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等步骤。本发明通过设计牡丹属逆转座子LTR序列引物，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带丰富，和应用其他物种上的LTR引物相比，本引物可直接用于牡丹种属之间多态性的分析，更具有高效性和实用性，在本发明中选择性扩增PCR体系得到优化，更适合牡丹属SSAP分子标记的扩增，改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，将银染中固定和染色步骤合二为一，进一步提高了SSAP分子标记在牡丹属上应用的效率。
发明专利
CN201310107900.1
2013-03-29
CN103184290A
2013-07-03
C12Q1/68(2006.01)I
河南科技大学
侯小改;郭大龙;张曦;宋程威;刘素云;赵威;马慧丽
471000 河南省洛阳市涧西区西苑路48号
洛阳公信知识产权事务所(普通合伙) 41120
罗民健
河南;41
一种SSAP分子标记技术在牡丹上的标记方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、设计引物设计Mse?I?和EcoR?I接头引物、预扩增PCR引物、接头选择性扩增PCR引物、逆转座子PCR引物，引物序列走向为5??端到3??端：1）接头引物Mse?I接头引物Mse?I5??端接头引物：Mzx5?GACGATGAGTCCTGAGMse?I3??端接头引物：Mzx3?TACTCAGGACTCATEcoR?I接头引物EcoRI5??端接头引物：Ezx5?CTCGTAGACTGCGTACCEcoRI3??端接头引物：Ezx3?AATTGGTACGCAGTCTAC2）预扩增引物Mse?I预扩增引物：Mzx00?GATGAGTCCTGAGTAACEcoR?I预扩增引物：Ezx00?GACTGCGTACCAATTCA3）选择性扩增引物接头选择扩增引物：Mzx02：GATGAGTCCTGAGTAACATMzx04：GATGAGTCCTGAGTAACAGMzx06：GATGAGTCCTGAGTAACTTMzx011：GATGAGTCCTGAGTAACCCMzx016：GATGAGTCCTGAGTAACGGEzx12：GACTGCGTACCAATTCACGEzx15：GACTGCGTACCAATTCAGC逆转座子引物：PLR1???GTGGTGGTTCATAGGTATTGTTPLR2???CTGAAGTCACTGTCACCGAAGPLR3???GCAATAGAAGCGTTACAGACAAPLR4???ATAAGCGACTTCTCCAATCCPLR5???ATCTTGTGGTGAAATGGGACPLR6???AACAAACCCAGATTCAGACGPLF7???CTTCAGCCCTGTAACCAACAPLF8???CAAGTCTGAGGAAGAACACGAG步骤二、牡丹基因组DNA的提取????选取牡丹新鲜的嫩叶，捣碎，利用CTAB法提取基因组DNA：1）将牡丹幼嫩叶片放入研钵内，加入100~130mg聚乙烯吡咯烷酮，再加入液氮迅速研磨至粉末状，转移研磨液至预先冷却、洁净的1.5ml离心管中，备用；2）向上述离心管中加入0.75ml煮沸的CTAB溶液，之后在温度为65℃的条件下水浴1h，水浴过程中，每隔5min颠倒混匀一次；3）待离心管冷却至室温后，取出离心管，向离心管中加入0.75ml氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀10min；4）将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心10min；5）将离心管内的上清溶液转移至另一1.5ml离心管内，再加入与上清溶液等体积的氯仿异戊醇溶液，颠倒混匀10min；6）将离心管放入离心机中，在12000rpm的条件下离心10min；7）将上清溶液转移至另一离心管中，加入离心管容积2/3的预冷无水乙醇，迅速颠倒混匀，然后放入温度为?20℃的冰箱内1h；8）用枪头挑出白色絮状物转移至另一离心管中，加入质量浓度为75%的乙醇浸泡10min；9）倒掉离心管内上清溶液，再加入质量浓度为75%的乙醇浸泡10min；10）倒掉上清溶液，室温下自然风干；11）加入50~500mlTE溶液，放入温度为?20℃的冰箱内备用；步骤三、牡丹基因组DNA中RNA的去除利用Takara?RNase?A试剂盒对提取的牡丹基因组DNA进行处理：取牡丹基因组DNA原液稀释至50ng/μl后加入1μl?RNase?A混匀，瞬时离心后在温度为37℃的条件下水浴1h，之后转入温度为?20℃的条件下保存，备用；步骤四、牡丹基因组DNA的酶切利用Takara酶切试剂盒中的Mse?I和EcoR?I限制性内切酶对步骤三中制备的牡丹基因组DNA进行酶切：?20μl的酶切反应液成分为：质量浓度为50ng/μl的基因组DNA5~10μl，稀释10倍后的NEBuffer4?2μl，稀释100倍后的BSA?0.2μl，Mse?I酶0.5μl，EcoR?I酶0.5μl，余量为双蒸水；具体步骤为：1）将限制性内切酶从冰箱内取出放置冰上；2）将DNA、NEBuffer4、BSA和双蒸水按上述量混匀，在温度为4℃的条件下放置30min；3）加入限制性内切酶，混匀，瞬时离心；4）在温度为37℃的条件下水浴1~3h，之后放入温度为4℃的冰箱内备用；步骤五、接头的准备1）将Mzx5、Mzx3和Ezx5、Ezx3接头引物稀释到50mmol/l；2）上述四种接头引物各取25μl两两配对混合均匀；3）将配对混合均匀后的接头引物放到PCR中，先在温度为94℃的条件下反应1min，然后在温度为36℃的条件下反应5min；4）室温下慢慢冷却，最后合成25μM的接头引物Mse接头和EcoR接头；步骤六、酶切产物和接头的连接利用Takara?T4?DNA?Ligase连接试剂盒进行连接1）在微量PCR离心管内配制25μl?PCR反应液，其成分为：牡丹基因组DNA酶切产物8μl，步骤五中的Mse接头引物和EcoR接头引物各2.5μl，T4?DNA连接酶1μl，稀释10倍后的Ligation?Buffer2.5μl，余量用双蒸水补齐至25μl；2）用移液枪枪头将上述反应液吸打充分混匀，瞬时离心后在温度为16℃的条件下保存，备用；步骤七、连接产物的预扩增1）将预扩增引物Mzx00和Ezx00稀释至20μM后备用；2）在微量PCR离心管配制25μl?PCR反应液，其成分为：连接产物2.5μl，稀释10倍后的Buffer?2.5μl，Mg2+?1.875μl，dNTP?0.5μl，Mzx00和Ezx00两种预扩增引物各0.5μl，Taq酶0.2μl，余量用双蒸水补齐至25μl；3）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃变性1min，50℃退火90s，72℃延伸90s?36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物；4）PCR扩增产物稀释20~40倍，备用；步骤八、选择性扩增反应1）将选择性扩增引物和逆转座子引物稀释到20μmol/l后备用；2）在200μl的PCR离心管内配制25μl?PCR反应液，其成分为：预扩增PCR产物稀释液5~10μl，稀释10倍后的Buffer2.5μl，Mg2+?1.875μl，dNTP?0.5μl，选择性扩增引物和逆转座子引物各0.5μl，Taq酶0.2μl，余量用双蒸水补齐至25μl；3）PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，68℃退火30s，采用touchdown，每个循环降0.7℃，72℃延伸1min?12个循环，然后再94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min?23个循环，最后72℃延伸5min；步骤九、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1）将电泳所使用的长、短玻璃板用水清洗后风干；2）用双蒸水清洗后风干，重复3次，每次间隔3min；3）用质量浓度为95%的酒精清洗后风干，重复3次，每次间隔3min；4）取1ml反硅化液和2μl反硅化剂均匀混合后涂在长玻璃板上，室温下放置5min后用质量浓度为95%酒精擦洗3次，每次间隔5min；5）取1ml剥离硅烷均匀涂于短玻璃板上，室温下放置5min后用质量浓度为95%的酒精擦洗3次，每次间隔5min；6）将两块儿玻璃板固定在一起，擦洗面向内，且两玻璃板不接触，用透明胶对长玻璃板和短玻璃板封边，夹夹子，之后以10°的倾斜角放于平稳实验台面上；7）室温下放置3~4分钟后倒入胶液，插入梳子，室温下凝胶4~6h；8）去夹子，撕掉透明胶带，将玻璃板外部冲洗干净，拔去梳子，立即冲洗拔去梳子后的点样孔；9）预电泳：将玻璃板固定于电泳槽上，上下槽各加入稀释1倍的500ml?TBE溶液，在75W，200V，80mA的条件下，电泳15～30min；10）在扩增产物中加入1/10体积溴酚蓝，取4μl上样，在恒定功率为80W的条件下电泳2～4h，待溴酚蓝跑至胶板高度的3/4处后停止电泳；11）漂洗：将玻璃板放入2L双蒸水中漂洗3次；12）固定和银染：加入染色固定液进行银染和固定20min，双蒸水漂洗3次，染色固定液的配制方法为：加入150ml无水乙醇，15ml冰醋酸，3g硝酸银，双蒸水定容至1.5L；13）显影：加入显影液进行显影8min，用双蒸水漂洗3次。