一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺
本发明公开了一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺,通过人工诱变育种,及工艺配方、培养条件的优化,使得原本在不同条件下培养,且分别具有不同生理功能的三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3,通过固体培养、摇瓶种子制备,然后将三株地衣芽孢杆菌的摇瓶种子液合瓶后,经过一级种子液制备、二级种子液制备,最后于同一发酵罐内发酵培养。采用本发明的混合发酵工艺,抑菌能力提高10~15%,芽孢率提高了16~23%,节约成本200%。
发明专利
CN201310101292.3
2013-03-26
CN103146624A
2013-06-12
C12N1/20(2006.01)I
山西凯盛肥业有限公司
张晓红;刘姝静;朱慧平;张中亲
044004 山西省运城市盐湖工业科技园复旦大街山西凯盛肥业有限公司
北京英特普罗知识产权代理有限公司 11015
齐永红
山西;14
一种三株地衣芽孢杆菌混合液体发酵工艺,所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)分别为L1、L2、L3,保藏于中国农业微生物菌种保藏中心;其中,L1的保藏编号为ACCC11080,L2的保藏编号为ACCC10613,L3的保藏编号为ACCC11106;其特征在于,包含以下步骤:a)固体斜面培养:将三株地衣芽孢杆菌L1、L2、L3在无菌条件下分别接种于斜面培养基上进行分别培养,其中:地衣芽孢杆菌L1的培养条件为30~37℃,24~48h,地衣芽孢杆菌L2的培养条件为25~30℃,24~48h,地衣芽孢杆菌L3的培养条件为28~32℃,24~48h;b)理化因子诱变:将步骤a)中制得的固体斜面培养物,在无菌条件下,分别用0.9%的生理盐水制备成浓度为108~109个/ml(血球计数浓度)的菌悬液;然后将制得的菌悬液进行紫外诱变处理,按照致死率70%~90%的处理剂量进行摇瓶筛选,根据摇瓶筛选结果,选择正突变的菌株,进行亚硝基胍诱变处理,并用0.9%的生理盐水将亚硝基胍诱变处理后的反应液稀释后涂布分离平板,接入分离平板培养基,于30℃培养48h,至长出单菌落;c)摇瓶筛选:无菌条件下,将步骤b)中制得的单菌落从分离平板上分别接入斜面培养基,于30℃培养48h,得单菌落斜面;然后将单菌落斜面一对一接入种子摇瓶培养基,于30℃恒温振荡培养22h,得筛选种子液;再在无菌条件下,将筛选种子液以5%的接种量接入摇瓶发酵培养基,于30℃恒温振荡培养48h,以芽孢率、抑菌能力(抑菌圈)、生物量为指标,进行摇瓶初筛、摇瓶一次复筛及摇瓶二次复筛;d)根据步骤c)中的二次复筛结果,选取芽孢率≥90%、抑菌圈≥20mm、生物量≥20%的菌株,分别用接种针接入斜面培养基,于30℃培养48h,得二代种子斜面,然后在无菌条件下,将二代种子斜面用接种铲接入种子摇瓶培养基,于30℃培养22h,得摇瓶种子液;e)发酵培养:将步骤d)中的摇瓶种子液合瓶,然后接种种子罐培养基,经过一级种子液和二级种子液制备后,进入发酵罐接种发酵培养基进行培养,培养温度为30±0.5℃,罐压:0.03~0.05MPa,pH值为6.3~6.6,流量1:0.3~1:0.8,转速300rpm,至芽孢率大于85%时放罐。