一种microRNA的二次循环扩增检测方法及试剂盒
本发明提供一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法及诊断试剂盒,本发明检测方法只需要一步操作就可以完成二次循环扩增反应,高灵敏度,可以检测到15ul反应体系中的9条RNA链。设计简单,不需要涉及纳米材料的合成和修饰等。噪声很低,从而也增加了灵敏度,特异性和通用性。与传统的Northern印迹分析,微点阵分析方法相比,所需要的样品量很少,特异性很好。与实时定量PCR相比,该方法是恒温反应,使得实验在普通的荧光仪上就可以实现,扩大了方法的使用范围,而且序列的设计简便。该方法可以检测出单个乳腺癌细胞水平的miRNA。本我们可以利用此技术设计肿瘤诊断试剂盒和设备。
发明专利
CN201310007183.5
2013-01-09
CN103088128A
2013-05-08
C12Q1/68(2006.01)I
华中科技大学
夏帆;段瑞雪;陈志飞;左小磊
430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号
华中科技大学专利中心 42201
夏惠忠
湖北;42
一种miRNAs的二次方循环扩增检测方法,包括以下步骤:步骤一:37℃条件下的标准曲线:取5‑8个1.5ml的离心管,分别加入分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI,另外设计5‑8个浓度梯度(10fM‑100nM)的miRNA样品分别加入到以上离心管中37℃恒温孵育2h;所述的分子信标探针的核苷酸序列为:其5′端的两个碱基有硫代标记,3′端标记有淬灭基团DABCYL,另外还含有Nb.BbvCI切刻酶的切刻位点GCTGAGG(下划线);靠近5′端第10个碱基处标记有荧光基团FAM;所述的8个碱基的引物的核苷酸序列为:其5′端的两个碱基也是硫代标记。步骤二:荧光仪上进行检测,即可得到不同浓度的miRNA样品对应的荧光强度,荧光仪的设置参数如下:激发和发射狭峰宽度均为5nm,电压PMT 700v,激发波长为490nm,发射波长扫描范围500~600nm,根据荧光强度和miRNA样品浓度可得37℃条件下的检测标准曲线;步骤三:改变步骤一中的反应条件为4℃恒温孵育50h,其它条件不变,可得4℃条件下的检测标准曲线;步骤四:对于乳腺癌细胞的检测,首先利用mirVanaTM试剂盒提取出细胞中的miRNA,作为待检测的样品,利用步骤一中的条件可以得到乳腺癌细胞的检测标准曲线;步骤五:将分子信标探针、8个碱基的引物、dNTPs、Bst聚合酶、Nb.BbvCI切刻内切酶、lambda核酸外切酶、BSA、RRI、以及待测样品加入到1.5ml的EP离心管中恒温孵育2h,在荧光仪上进行检测,荧光仪的参数设置与步骤二中荧光仪的参数设置相同,得到的荧光强度和检测标准曲线相对应即可得到样品中含有的miRNA的浓度。FDA00002718425800011.tif,FDA00002718425800012.tif