一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法
本发明涉及单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，有效解决单产低、甲醇转化率不高的技术难题，将巴斯德毕赤酵母HGD-01的菌株接种至YPD试管斜面培养基上，培养得斜面种子，斜面种子接入到YPD液体培养基的中，培养得摇瓶种子；将摇瓶种子接种到另取的YPD液体培养基中，培养一级种子；将一级种子接种到BSM液体培养基中，培养得二级种子；将二级种子接种到发酵培养基中开始发酵，得发酵液；发酵液导入到发酵液储罐中，静置，沉降，然后离心得菌泥，加清水，搅拌均匀，喷雾干燥，本发明所生产单细胞蛋白粗蛋白含量达55%以上，氨基酸总量达50%以上，发酵菌种对发酵条件适应性强，生产的饲料安全无毒。
发明专利
CN201310001734.7
2013-01-05
CN103060212A
2013-04-24
C12N1/16(2006.01)I
义马煤业集团煤生化高科技工程有限公司
乔国厚;王兰甫;苟万晓;胡元森;张寅;曹敏;樊崇;张国杰;许宗浩;卫红伟;田亚鹏;朱广有;王霞
472300 河南省三门峡市义马市煤化工产业集聚区
郑州天阳专利事务所(普通合伙) 41113
宋金鼎
河南;41
一种单细胞甲醇蛋白的工业化生产方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、分类命名为巴斯德毕赤酵母HGD??01的菌株，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC??NO:M2012342；将甘油管保藏的巴斯德毕赤酵母HGD??01的菌株0.5mL接种至YPD试管斜面培养基上，30℃培养48小时，即得斜面种子，所述的YPD试管斜面培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂和余量的水混合在一起组成；用无菌水将斜面种子全部冲洗下来，以YPD液体培养基体积1%～5%的接种量接入到YPD液体培养基的中，摇床振荡培养，培养温度30℃，摇床转速220rpm，培养24～30小时，菌体OD600达到3～5，获得摇瓶种子，所述的YPD液体培养基是由重量百分比计的1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、2%葡萄糖和余量的水混合在一起组成；2）、一级种子培养：A、一级种子培养在50L的发酵罐中进行，步骤如下：按步骤1）所述方法在50L罐中配制30L的YPD液体培养基，打开蒸汽阀，使蒸汽进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行灭菌，灭菌温度121℃，灭菌时间30min，对YPD液体培养基灭菌的同时，对空气过滤器和取样口进行灭菌，灭菌10min即可，灭菌结束后，打开进气阀，向发酵罐中通入无菌空气，使罐体内空气压力一直要高于罐体外大气压，打开冷却水阀门，使冷却水进发酵罐夹套层，对YPD液体培养基进行降温，当YPD液体培养基温度降至25??35℃时，开始接种；B、摇瓶种子1000mL从50L发酵罐接种口倒入，随后控制发酵温度在28～30℃，转速150rpm，溶氧40%～50%，培养20～24h后，得一级种子；3）、二级种子培养：二级种子培养在5m3发酵罐中进行，二级种子培养基采用BSM液体培养基，步骤如下：5m3发酵罐中装BSM液体培养基体积为3m3；所述的BSM液体培养基为：质量浓度85%磷酸15L/m3，二水硫酸钙0.4Kg/m3，硫酸钾8Kg/m3，七水硫酸镁6Kg/m3，甘油36Kg/m3和微量元素溶液3L/m3加水制成，也就是说BSM液体培养基为质量浓度85%磷酸15L，二水硫酸钙0.4Kg，硫酸钾8Kg，七水硫酸镁6Kg，甘油36Kg和微量元素溶液3L加水至1m3；所述的微量元素溶液为：五水硫酸铜14g/L，碘化钾0.08g/L，一水硫酸锰4g/L，二水钼酸钠0.1g/L，硼酸0.1g/L，六水合氯化钴1g/L，氯化锌36g/L、七水合硫酸亚铁65g/L和质量浓度为98%的浓硫酸5mL/L加水制成，也就是说微量元素溶液为五水硫酸铜14g，碘化钾0.08g，一水硫酸锰4g，二水钼酸钠0.1g，硼酸0.1g，六水合氯化钴1g，氯化锌36g、七水合硫酸亚铁65g和质量浓度为98%的浓硫酸5mL加水至1L；用2）A步骤中对YPD液体培养基相同的灭菌方法对BSM液体培养基进行灭菌，灭菌完成后，用质量浓度为35%的氨水调BSM液体培养基pH值至4.8～5.0，然后将培养好的一级种子30L接种到3m3的BSM液体培养基中，接种量为1%，接种时二级种子罐罐压在0.01??0.03MPa，一级种子罐罐压在0.05??0.1MPa，通过空气压力将一级种子从一级种子罐压到二级种子罐中，接种完成后，保持二级种子罐温度30～32℃，通风比1：1~1.5vvm，罐压0.05MPa，pH5.0～5.5，培养24~30h，得二级种子；4）、发酵罐甲醇蛋白生产发酵培养基为与3）步骤中的二级种子的BSM液体培养基相同的培养基，开启进料泵，调节进料阀门大小，以控制发酵培养基的进料速度为3～4m3/h，同时打开蒸汽阀门，将蒸汽与发酵培养基混合，使发酵培养基温度达到121??125℃，进入在层流罐中维持20min后，进入50m3发酵罐中，进料完毕后，关闭进料阀，并将50m3发酵罐温度维持在121℃30min，此时，用蒸汽对与50m3发酵罐相连的空气过滤器、发酵罐取样口、出料口、排气口管道进行灭菌，保证50m3发酵罐及与之相连管道呈无菌状态，灭菌结束后，对50m3发酵罐内的发酵培养基降温到30℃～35℃；用质量浓度为35%的氨水调发酵培养基至pH5.0，然后将二级种子以发酵培养基体积10%的接种量接种到50m3发酵罐内pH值为5.0的发酵培养基中开始发酵，发酵温度30～32℃，通风比1：1.5~2??vvm，罐压0.04MPa，pH5.0～5.5，培养16~20h，罐内料液中的甘油消耗完，溶氧开始持续上升，罐内菌体OD600达到36～40，湿重达到100～120g/L，向50m3发酵罐内流加甲醇，甲醇流加量为5～6克/升·小时，当溶氧高于60%以上时，加大甲醇流加量，最大流加量达到10～15克/升·小时，发酵过程中，每12小时补加一次微量元素溶液，每次流加20升，直至发酵结束，发酵72～84小时后，取样测定菌体湿重达350～400g/L，发酵结束，得发酵液；5）、出料发酵结束后，利用罐压将发酵液从出料管道导入到发酵液储罐中，静置，沉降4～8小时，沉降液经卧螺离心机离心，得菌泥，收集到储存罐中，加入菌泥体积1/5的清水，搅拌均匀，进入喷雾干燥机，喷雾干燥，收集蛋白干粉。