TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用

摘要：

本发明TALE重复单元四聚体库的构建方法、TALEN表达载体的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。所述四聚体库的构建包括构建TALE单个重复单元、构建TALE单体质粒以及在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNA Ligase进行酶切-连接反应得到TALE重复单元四聚体库的过程。TALEN表达载体是基于TALE重复单元四聚体库构建所得。本发明具有通过PCR扩增和酶切-连接过程就可以构建TALE重复序列四聚体质粒库以及基于四聚体质粒库构建得到TALEN表达载体，减少了成本的投入、减化了构建方法的优点。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201210580350.0

申请日期：2012-12-28

公开/公告号：CN103146735A

公开/公告日：2013-06-12

主分类号：C12N15/63(2006.01)I

申请/专利权人:西北农林科技大学

发明/设计人:张智英;张志强;李铎;辛颖;麻丽霞;王昕;张涛;徐华荣

主申请人地址:712100 陕西省咸阳市杨凌区邰城路3号西北农林科技大学

国别省市代码:陕西;61

权利要求：

TALE重复单元四聚体库的构建方法，包括下述步骤：(1)、PCR扩增TALE单个重复单元：以TALE单个重复片段monomer NI为模板，用TALE‑F1/TALE‑R1为引物PCR扩增得到TALE单体NI1、NI2、NI3、NI4；以TALE单个重复片段monomer NG为模板，用TALE‑F2/TALE‑R2为引物PCR扩增得到TALE单体NG1、NG2、NG3、NG4；以TALE单个重复片段monomer HD为模板，用TALE‑F3/TALE‑R3为引物PCR扩增得到TALE单体HD1、HD2、HD3、HD4；以TALE单个重复片段monomer NN为模板，用TALE‑F4/TALE‑R4为引物PCR扩增得到TALE单体NN1、NN2、NN3、NN4，其中monomer NI识别A碱基、monomer NG识别T碱基、monomer HD识别C碱基、monomer NN识别G碱基；(2)、将步骤(1)构建所得的TALE单体插入线性化pGEM‑T easy载体中，得到相应的16个TALE单体质粒pGEM‑T‑NI1、pGEM‑T‑NI2、pGEM‑T‑NI3、pGEM‑T‑NI4、pGEM‑T‑NG1、pGEM‑T‑NG2、pGEM‑T‑NG3、pGEM‑T‑NG4、pGEM‑T‑HD1、pGEM‑T‑HD2、pGEM‑T‑HD3、pGEM‑T‑HD4、pGEM‑T‑NN1、pGEM‑T‑NN2、pGEM‑T‑NN3和pGEM‑T‑NN4；(3)、在T4DNA连接酶缓冲液中加入TALE单体质粒，同时加入BsaI内切酶和T4DNALigase进行酶切‑连接反应，所述TALE单体质粒为pGEMT‑Momomer1，pGEMT‑Monomer2，pGEMT‑Monomer3和pGEMT‑Monomer4，得到含256个四聚体质粒的TALE重复单元四聚体库，其中pGEMT‑Momomer1为pGEM‑T‑NI1、pGEM‑T‑HD1、pGEM‑T‑NG1或pGEM‑T‑NN1中的一个，pGEMT‑Monomer2为pGEM‑T‑NI2、pGEM‑T‑HD2、pGEM‑T‑NG2或pGEM‑T‑NN2中的一个，pGEMT‑Monomer3为pGEM‑T‑NI3、pGEM‑T‑HD3、pGEM‑T‑NG3或pGEM‑T‑NN3中的一个，pGEMT‑Monomer4为pGEM‑T‑NI4、pGEM‑T‑HD4、pGEM‑T‑NG4或pGEM‑T‑NN4中的一个。