一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法
本发明公开了一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，该方法利用DC具有的高粘附性，并结合密度梯度离心的方法分离纯化外周血中DC的方法，用于后续的DC培养，并用患者肿瘤制备的特异性抗原致敏活化DC，本发明方法具有如下优点：操作方便，肿瘤抗原易于获取和制备，并且经肿瘤患者自身抗原致敏的DC特异性强、可激发抗肿瘤CTL有效的抗肿瘤免疫，并减小了感染其它外源性疾病的风险，有利于在临床推广应用，用于各类肿瘤的治疗。
发明专利
CN201210464416.X
2012-11-19
CN102925412A
2013-02-13
C12N5/0784(2010.01)I
昆明理工大学附属医院
严新民;董虹;唐慧
650032 云南省昆明市西山区金碧路157号
云南;53
一种制备肿瘤特异性抗原致敏DC的方法，其特征在于按如下步骤进行：(1)患者肿瘤抗原的制备：取无菌肿瘤组织，完全浸没于质量百分比浓度为0.05％的醋酸洗必泰溶液中，浸泡20?40分钟后，无菌生理盐水冲洗2?4次后，剪碎，按每克肿瘤组织添加10?15ml的RPMI?1640培养液的比例在肿瘤组织中添加培养液，研磨，过滤单细胞，收集单细胞悬液；(2)用RPMI?1640培养液调整单细胞悬液浓度为0.5?2.5×107个/ml，细胞悬液经42℃水浴加热1?1.5小时后，60℃水浴继续加热1?1.5小时后，液氮速冻5?15分钟，取出后于室温融化，重复以上步骤4?6次后，300?500g离心15?25分钟，收集上清，上清经无菌滤器过滤除菌后，即得肿瘤抗原，用BCA法测定蛋白质浓度；(3)在血细胞分离机上采集肿瘤患者单个核细胞血浆悬液50?100ml，悬液中细胞总数为1.0?5.0×109个，将收集到的单个核细胞血浆悬液加入等体积的淋巴细胞分离液中300?500g离心20?40分钟，然后吸取界面层的单个核细胞，加入到RPMI?1640培养基中，150?250g离心5?15分钟，重复离心洗涤2?5遍，收集单个核细胞；(4)将经离心洗涤的单个核细胞悬浮于含体积百分比10％胎牛血清的RPMI?1640培养基中，并调整细胞数为2.0?6.0×106个/ml，将细胞悬液转入无菌培养瓶中，于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中贴壁培养2?4小时后，取出培养瓶，水平方向轻轻摇晃培养瓶5?10次后，弃去含非贴壁细胞的培养液，再次缓缓加入RPMI?1640培养基，轻轻晃动洗去残留非贴壁细胞；(5)往保留有贴壁细胞的培养瓶中加入含体积百分比10％胎牛血清、30?100ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和5?25ng/ml重组人白细胞介素?4的RPMI?1640培养基中，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中继续培养，培养至第3?4天，补充新鲜的含体积百分比10％胎牛血清、30?100ng/ml的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和5?25ng/ml重组人白细胞介素?4的RPMI?1640培养基，继续培养，在培养到第7?14天终止培养，用吸管轻轻吹打贴壁细胞，使细胞从培养瓶壁上脱落下来，收集培养液于离心管中，100?300g离心5?15min，收集细胞，即得到未致敏的DC；(6)将未致敏的DC重悬于含体积百分比10％胎牛血清、终浓度为30?100ng/ml的rhGM?CSF、终浓度为5?25ng/ml的rhIL?4的RPMI?1640培养基中，调整细胞数为1.0?3.0×106个/ml，加入步骤(1)中制备所得的肿瘤抗原至终浓度20?100ug/ml，置于37℃、5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养6?24小时，用吸管吹打培养瓶使特异性抗体致敏的树突状细胞悬起，收集细胞悬液于离心管中，100?300g离心5?15min，收集细胞，然后用无菌生理盐水重悬细胞，100?300g离心5?15min，重复该步骤2?5次，收集细胞，即得到特异性肿瘤抗原致敏的DC。