Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法
本发明公开一种Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株及其制备方法，能将流行的Ⅱ型登革病毒株在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应，从而得到能稳定传代且病毒扩增量高的细胞适应株，经噬斑纯化获得毒力较强、纯度较高的纯化株，经鉴定，该病毒纯化株保持了原始毒株的基本生物学特性，且具有较好的抗原性。能够以人胚肺二倍体细胞KMB17为基质，进行Ⅱ型登革病毒扩增，打破了Ⅱ型登革病毒宿主细胞的局限性，为具有我国地域特色的预防登革病毒疫苗的研发开拓新的思路，为研发Ⅱ型登革病毒灭活和减毒活疫苗奠定基础，同时也具备大规模生产的可行性，此疫苗的研发将产生巨大的经济价值和社会效益。
发明专利
CN201210446494.7
2012-11-09
CN102911920A
2013-02-06
C12N7/00(2006.01)I
中国医学科学院医学生物学研究所
孙强明;赵玉娇;潘玥;陈俊英;杨丽娟;岳耀斐;黄新伟;施海晶;丁晓洁
650118 云南省昆明市茭菱路935号
昆明正原专利商标代理有限公司 53100
徐玲菊
云南;53
一种Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株，其特征在于通过下列步骤获得：1）、按1ml病毒液/瓶的量，将浓度为4.0MOI的Ⅱ型登革病毒液接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI?1640培养基?+?2%体积比的小牛血清?+?2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时，收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；2）、将步骤1所得病毒液，按1ml病毒液/瓶的量,接种到生长致密，透明度好的白纹伊蚊细胞C6/36上，于温度为28+2℃、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，按1:9的体积比，补加下列病毒维持液：RPMI?1640培养基?+?2%体积比的小牛血清?+?2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，于相同环境中，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第8～9天，当白纹伊蚊细胞C6/36病变CPE达++++时,收集细胞液，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，即得病毒液；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液；3）、按1ml病毒液/瓶的量，将步骤2所得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液，接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液：MEM培养基?+?5%体积比的小牛血清?+?2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠，于温度为37+0.5℃、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至第7天，当人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，收获已出现细胞病变CPE的病毒液，并于?70℃下保存；4）、将步骤3的病毒液反复冻融2次，于4℃，3500×g离心分离5min，收获上清，得病毒液，将该病毒液按1ml病毒液/瓶的量接种到铺满单层、生长状态良好且致密的人胚肺二倍体细胞KMB17上，同时按1:9的体积比，加入下列病毒维持液:MEM培养基?+?5%体积比的小牛血清?+?2%体积比的质量浓度为6.6%的碳酸氢钠；于温度为37+0.5℃、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温培养至第4天，于相同环境下，按2%的体积比补加质量浓度为6.6%的碳酸氢钠溶液，培养至人胚肺二倍体细胞KMB17病变CPE达++++时，获得能够在KMB17?细胞上增殖的登革病毒毒种，并于?70℃下保存；如此连续传代培养三代以上，直至获得传代稳定的Ⅱ型登革病毒液，即得到在人胚肺二倍体细胞KMB17上适应的Ⅱ型登革病毒适应株。