一种以芸薹属植物基因表达的变化来检测镉污染的方法
本发明公开了一种以芸薹属植物基因表达的变化来检测镉污染的方法，从镉处理和对照的芥菜（Brassicajuncea）根中提取总RNA后与29K拟南芥芯片杂交，发现了镉诱导的特异表达的上调和下调基因，在这些基因的保守区设计引物，采用半定量PCR法，以表达量的增加或减弱2.00倍为标准，筛选并确定了当镉浓度大于1.00mg/kg时芥菜特异表达的6个上调基因和6个下调基因，利用这12个基因的引物检测环境中芸薹属植物的根中基因表达的变化，如6个上调基因引物扩增的待测环境中芸薹属植物的产物亮度比对照都增加2.00倍以上，且6个下调基因引物扩增的待测环境中芸薹属植物的产物亮度比对照都减弱2.00倍以上，则可以判定检测环境中镉的浓度大于1.00mg/kg，从而得知待检测环境中的芸薹属植物是否遭到镉污染。这种检测方法灵敏度高且特异性强，可以快速检测芸薹属植物所处的环境中镉的含量是否适用于农业生产。
发明专利
CN201210416258.0
2012-10-26
CN102912023A
2013-02-06
C12Q1/68(2006.01)I
中南大学
严明理;冯涛;向言词;刘丽莉;柴立元;李夕兵
410083 湖南省长沙市麓山南路932号
张家界市慧诚商标专利事务所 43209
高红旺
湖南;43
?一种以芸薹属植物基因表达的变化来检测镉污染的方法，其特征在于，步骤包括:步骤一：确定镉诱导下特异表达的上调基因和下调基因，方法如下:选取饱满、干净的芥菜种子，用75%乙醇浸泡1?min，然后在0.1%升汞中灭菌10?15?min，无菌水冲洗2?3次，在无菌水中浸泡5?6小时后，用滤纸吸干多余的水分，接种于1/2?MS固体培养基上，MS固体培养基的pH值为?6.0，其中含5g/L?蔗糖，0.7?%?琼脂，镉（Cd2+）浓度水平分别为0mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg和1.5mg/kg，日夜长比为14/10h,?日夜温为22/16℃,光照强度为200?μmol?m–2?s–1；在无菌条件下温室中生长15天，取固体培养基中的油菜根部进行实验；采集镉处理和对照组芥菜的根，进行总RNA的提取，与拟南芥29K表达芯片杂交并进行信号分析；根据杂交信号的分析结果，找到芥菜镉诱导下特异表达的拟南芥同源的上调和下调基因，再利用同源克隆的方法在芥菜中克隆这些基因片段，以克隆这些基因片段序列为基础，在NCBI?BLAST中找到基因的保守区，在保守区利用软件Primer?Premier?5.0设计引物，以Actin基因的表达为参照，采用半定量PCR法检测目的基因的表达，重复3次；PCR反应的总体积为10μL；进行PCR扩增温度如下：先94℃?3min，再94℃,?25s;?60℃,?25s;?72℃,?30?s,?28个循环后，72℃延长6?min，反应结束后，得扩增产物；取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳15?30min后在紫外仪上观察，并利用图像软件分析扩增产物的亮度；以平均亮度增加或减弱2倍以上为标准，筛选并确定了芥菜镉浓度大于1.00mg/kg诱导下特异表达的6个上调基因和6个下调基因，以此作为镉污染检测的基因；所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著上调基因的引物（正向引物简称F,?反向引物简称R）具序列如下：?UP1：F:5'??CGGAGTGGCTAAGCTTGTTCG?3'???R:5'?CCACAAGACCAAACATCAGCG?3'???UP2：F:5'?GCTGTCAAAGCTGGTGAAACC?3'???R:5'??CCGCAATCCTCAGCTAGAGC?3'?UP3：F:5'?AAGAGCAAGCCAAGGAAGG?3'?????R:5'?GGCACTGTGGGCGAAGTAG?3'UP4：F:5'?AATGGCGGATTTGAGGGAC?3'??????R:?5'?GCGGTGGTTGGTGTTTGTT?3'UP?5：F:5'?CTCTTTCAGACCGTTGTTC?3'???????R:5'?TCACTTTCTGCTCCTTTAT?3'UP?6：F:5'?GGTGGATGTGAACGGTAAG?3'?????R:5'?CCAACGCAGTTTGAATGTC?3'所述芥菜镉诱导下特异表达的6个显著下调基因的引物（正向引物简称F,?反向引物简称R）具序列如下：?DOWN1：F:5'?TTTTCTTCCGACAAATCAG?3'???R:5'?CAATATGTTCCCTTTCACC?3'DOWN?2：F:5'?GCTTCTCAAGTACAACCCTA?3'???R:5'?CTAAACATTTCAAACCCTCA?3'DOWN?3：F:?5'?GTAAGTGGGTTTGTGAGGT?3'???R:5'?GAAATTGAGACAGGCTGAT?3'DOWN?4：F:5'?ACTTCGCTGACTCGGCTTGG?3'???R:5'?CAGACGGCGGCGGTAAAA?3'DOWN?5：F:5'?GGTATTAGGGTTTGGCTCG?3'???R:5'?TGGTCATTCTCCGTCTCA?3'???DOWN?6：F:?5'?CAGCCCTGAATCCTGACC?3'???R:5'?GCCTTGACCAAAGCCACA?3'??步骤二：检测环境中的镉污染，方法如下:?1)采集待检测环境及非污染对照区中的在分类学上属于同种的芸薹属植物的根，进行根的总RNA的提取和反转录；2）以Actin基因的表达为参照，采用半定量PCR法，重复3次；PCR反应的总体积为10μL；进行PCR扩增温度如下：先94℃?3min，再94℃,?25s;?60℃,?25s;?72℃,?30?s,?28个循环后，72℃延长6?min，反应结束后，得扩增产物；每个样品取扩增产物，加1/5倍体积的上样缓冲液，经2%的琼脂糖凝胶电泳15?30min后在紫外仪上观察，并利用图像软件分析扩增产物的亮度；3)作出结论:?若用引物UP1、?UP2、UP3、UP4、UP5和UP6扩增的待检测环境中芸薹属植物的亮度比对照都增加2倍以上，且引物?DOWN1、?DOWN2、DOWN3、DOWN4、DOWN5和DOWN6扩增的待检测环境中芸薹属植物的亮度比对照都减弱2倍以上则可以判定检测环境中镉污染的浓度大于1.00mg/kg，根据国家环境质量标准（GB15618?1995）认定待检测环境不适合农业生产。