Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法
本发明公开了一种Trx-hPTN融合蛋白及其生产方法，主要包括以下步骤：克隆hPTN基因，得质粒hPTN/pMD20-T；构建原核表达载体，得重组载体pET32a(+)/hPTN；将重组载体转化到大肠杆菌宿主中，得到大肠杆菌表达菌株转化子；将所得转化子经IPTG诱导得Trx-hPTN融合蛋白；利用镍亲和层析、PBS透析和超滤浓缩纯化，得纯度90%以上的Trx-hPTN融合蛋白。本发明所述的生产方法，利用pET32-a(+)作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶Trx-hPTN融合蛋白的方法，既保证了Trx-hPTN融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。
发明专利
CN201210415337.X
2012-10-25
CN102965387A
2013-03-13
C12N15/70(2006.01)I
中国科学院广州生物医药与健康研究院
吴东海;李洪波;胡兴;徐爱民;李鹏;金守光;李娜
510530 广东省广州市广州科学城开源大道190号
广州华进联合专利商标代理有限公司 44224
万志香%秦雪梅
广东;44
一种Trx‑hPTN融合蛋白的生产方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）克隆hPTN基因：用特异引物扩增出完整的基因片段，所用hPTN特异引物中引入BamH I酶切位点和Hind III酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得质粒hPTN/pMD20‑T，经过测序确定为正确表达序列；（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32a(+)和步骤（1）所得的质粒hPTN/pMD20‑T经过Hind III及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32a(+)/hPTN；（3）大肠杆菌表达菌株转化子的筛选：利用T4DNA连接酶连接，将步骤（2）所得的重组载体pET32a(+)/hPTN转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32a(+)/hPTN；用热激法将重组载体pET32a(+)/hPTN转入到大肠杆菌表达菌株Rosetta中，LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组载体pET32a(+)/hPTN的大肠杆菌表达菌株转化子；（4）Trx‑hPTN融合蛋白的表达：将步骤（3）所得的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD600为0.4‑0.8时，加入浓度为0.05‑1.0mM的IPTG，于25‑37℃诱导4‑10小时，超声破碎，离心取上清液，得到重组融合蛋白Trx‑hPTN；（5）Trx‑hPTN融合蛋白的纯化：利用镍亲合层析法对Trx‑hPTN融合蛋白进行纯化。