一种RNA的预备模板PCR检测方法
本发明提供了一种RNA的预备模板PCR(Template-Ready?PCR,TRPCR)检测方法。本发明方法与采用传统的RT-PCR方法相比,不需要纯化抽提RNA,不需要进行逆转录反应,将原本长达3个小时以上的PCR前处理过程缩短为约50分钟,因此,操作简便快速易行,具有较高的RNA检测的灵敏度和特异性,适合对各种来源的样品裂解得到RNA进行检测。
发明专利
CN201210371539.9
2012-09-27
CN102864233A
2013-01-09
C12Q1/68(2006.01)I
浙江今复康生物科技有限公司
陈燃;伍迪;金晓铮
310052 浙江省杭州市滨江区滨安路688号天和科技园2幢B楼1层
杭州天正专利事务所有限公司 33201
黄美娟%冷红梅
浙江;33
一种RNA的预备模板PCR检测方法,所述方法包括:(1)设计与目标RNA上任意一段序列互补的长度为25~40mer的单链寡核苷酸DNA,记为探针A;探针A的GC含量为40~60%,解链温度为70~85℃;将探针A锚定在PCR管内,得到锚定PCR管;(2)设计部分序列与目标RNA上另一段任意序列互补的单链寡核苷酸DNA,其结构为:?两端是特异的长度为20~30mer的PCR引物序列、中间为与目标RNA互补的长度为25~40mer的序列,记为探针B;探针B?的GC含量为40~60%,解链温度为70~85℃,与探针A和目标RNA的结合区域互不重叠;(3)取待测样本,加入探针B和含表面活性剂的细胞裂解液,反复吸打,转移至离心管中,冰上放置20min,4℃离心,取上清液,得到裂解上清液;(4)取裂解上清液20uL至锚定PCR管中,60~70℃保温5~15min,吸干管内液体,以洗涤液洗涤3~9次,吸干,加入20uL?由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液,进行PCR扩增,扩增产物进行荧光定量分析;(5)以空白裂解液作为阴性对照,按照步骤(1)和(2)方法进行处理和分析,以样本Ct值小于空白裂解液Ct值判断为阳性。