一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法
本发明涉及一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法，包括下列步骤：(1)以光皮桦种子为外植体培养得到组培苗；(2)选取幼嫩的组培苗叶片接入预培养基中，黑暗培养；(3)用MS培养基重悬培养基重悬离心收集的农杆菌菌体制得农杆菌菌液；(4)将预培养的叶片，投入农杆菌菌液中侵染一段时间后取出外植体，转入共培养基培养；(5)共培养后的材料转入筛选培养基中诱导不定芽的再生；(6)生根培养；(7)炼苗移栽。本发明建立了农杆菌介导的光皮桦遗传转化体系，为通过转基因技术深入研究并发掘光皮桦的最佳使用价值奠定了基础。
发明专利
CN201210343867.8
2012-09-17
CN102978235A
2013-03-20
C12N15/82(2006.01)I
浙江农林大学
童再康;李美飞;黄华宏;楼雄珍;姜小凤
311300 浙江省临安市环北路88号
浙江;33
一种利用农杆菌介导的光皮桦转基因方法，其技术方案按如下步骤进行：(1)培养基配方预培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L(PH5.9)共培养培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+AS300μmol/L(PH5.5)选一培养基配方：MS+TDZ0.4mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L (PH5.9)选二、选三培养基配方：MS+BA0.5mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+Carb500mg/L+Hyg10mg/L (PH5.9)生根培养培养基配方：1/2MS+IBA1mg/L+蔗糖20g/L+琼脂5.5g/L (PH5.9)AS(乙酰丁香酮)、Carb(羧苄青霉素)和Hyg(潮霉素)都在培养基倒板前温度低于50℃时再加入，防止失效。(2)光皮桦组培苗的准备A：种子消毒灭菌：将收集的光皮桦种子放入50ml无菌离心管中，倒入70％酒精消毒1‑2分钟；倒去酒精，加入40ml0.1％升汞溶液，浸泡5min；倒去升汞溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4‑5遍。B：小苗诱导与继代培养：将灭好菌的种子放在无菌滤纸上吸干水分，置入MS培养基中；操作完毕后用封口膜(MicroporeTM Surgical Tape)封好培养皿，在25℃‑28℃下光照培养2周；将发芽的小苗置入继代培养基1/2MS，每瓶3‑4株，培养2‑3个月(25℃‑28℃下光照培养)。(3)预培养选取长势较好的组培苗的叶片为外植体。选取其前3片较幼嫩的叶片，用剪刀在叶片上剪2‑3道伤口(深达叶脉)，较大的叶片可剪成0.5cm大小，接入预培养培养基，每皿40‑50片，暗培养7天。(4)农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100μl于5mlYEP(含50mg/LKan和50mg/LStr)培养基中，28℃，250rpm振荡培养20‑36h至饱和，再按0.2％‑0.3％的比例，转入含有抗生素的YEP培养基中，相同条件下培养12‑16h，当0D600的值为0.8‑1.0时即可用于转化。(5)转化和共培养A：取培养好的菌液100ml分装于50ml离心管中，4000rpm，离心20‑30min，去上清。用含300μmol/LAS的100mlMS感菌液(PH5.5)制成悬浮液，使菌液0D600终浓度为1.0；B：将预培养过的光皮桦叶片放入农杆菌悬浮液中侵染20min；C：取出叶片，置于无菌滤纸上沥干10‑20min；D：将叶片置于共培养培养基上，25℃暗培养5天。(6)选择培养A：将共培养好的叶片转入选一培养基中，每皿10‑12片或每瓶4‑5片，25℃‑28℃光照培养3‑4周；B：将选一培养基上长出的带芽原基和微芽的愈伤块，转入选二培养基，每瓶4‑5块，光照培养4周；C：将选二上未达到生根要求的小苗和愈伤继续转入选三培养基，每瓶4‑5块，光照培养4周。(7)生根培养将长至1cm以上的小苗，转入生根培养基中培养，每瓶接1‑2株。(8)驯化移栽A、选取长势较好(根部和茎叶分化的较好)的试管苗，打开盖子，炼苗1‑3天；B、将幼苗取出，洗净小苗根部附着的培养基，然后移栽于温室花盆中(基质由泥炭：珍珠岩：蛭石按1∶1∶1配制)，再用1000倍液多菌灵浇透，盖膜一周，每天浇水，保证湿度，促进生根。