一种Thermus脂肪酶的固定化方法

摘要：

本发明公开了一种Thermus脂肪酶的固定化方法：将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/SiO2与pH8.0的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus thermophilus WL）的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3.5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；本发明所述固定化Thermus脂肪酶耐热范围40-100℃，pH值适应范围4.0-9.0，对金属离子，酶抑制剂及去污剂有较强的耐受性；具有极好的超顺磁性，易磁分离回收，较好的操作稳定性。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201210241464.2

申请日期：2012-07-12

公开/公告号：CN102994491A

公开/公告日：2013-03-27

主分类号：C12N11/14(2006.01)I

申请/专利权人:浙江大学

发明/设计人:章晓波;宋崇富

主申请人地址:310027 浙江省杭州市西湖区浙大路38号

专利代理机构:杭州天正专利事务所有限公司 33201

代理人:黄美娟%王兵

国别省市代码:浙江;33

权利要求：

一种Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法为：将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/SiO2与pH8.0的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，再加入以所述Tris‑HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus thermophilus WL）的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3.5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法获得：将序列号为AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大肠埃希氏杆菌为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO：1.12252；将含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO：1.12252的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、250rpm培养4h，获得培养液a，取培养液a以体积分数1%的接种量接种于新鲜LB液体培养基中，37℃、250rpm培养3h，获得培养液b，在培养液b中加入异丙基‑β‑D‑硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mM，37℃下培养4h，离心，将沉淀b加入pH7.9的Buffer A缓冲液中，在10KHz频率下进行超声裂解，离心，取上清液b进行Ni柱亲和层析，洗脱液经透析后，取截留液冷冻干燥，获得所述Thermus脂肪酶。