一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法

摘要：

本发明公开了一种α-淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，所述方法为：待筛选菌株依次接种到平皿培养基、斜面培养基、发酵培养基中培养，收集得到发酵液，取发酵液离心，取上清液用水稀释10-100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入0.1U/ml的唾液淀粉酶30?μl，?5?mmol/l?的Gal-G2-α-CNP?40?μl，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液90?μl（50?mmol/l，pH?6.0），40?μl待测样品。对照组为用等体积的缓冲溶液代替待测样品。用酶标仪于405?nm处检测Abs405，每5秒钟读一次数，直至Abs405不再增加。将Abs405相对于对照组降低30%以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。本发明提供的筛选方法简单有效，可以在短时间内筛选大量样品，灵敏度高，提高了检测效率。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN201210224287.7

申请日期：2010-12-25

公开/公告号：CN102864207A

公开/公告日：2013-01-09

主分类号：C12Q1/40(2006.01)I

申请/专利权人:浙江工业大学

发明/设计人:郑裕国;王远山;冯志华;薛亚平;王亚军;沈寅初

主申请人地址:310014 浙江省杭州市下城区朝晖六区潮王路18号

专利代理机构:杭州天正专利事务所有限公司 33201

代理人:黄美娟%王兵

国别省市代码:浙江;33

权利要求：

一种α?淀粉酶抑制剂产生菌的筛选方法，其特征在于所述方法为：(1)将待筛选菌株接种到平皿培养基上，20?37℃培养至长出单菌落，挑选单菌落，接种至斜面培养基上，20?37℃培养直到菌落长成；所述平皿培养基或斜面培养基的组成为：蔗糖5?30g/l，蛋白胨1?5g/l，酪氨酸0.5?2g/l，K2HPO4.3H2O?0.5?2g/l，KCl?0.5?2g/l，MgSO4．7H2O?0.5?2g/l，FeSO4.7H2O?0.1?1g/l，琼脂15?20g/l，溶剂为水，初始pH?6.0?7.5；(2)挑选步骤(1)得到的菌落接种至发酵培养基中培养，培养温度25?37℃，摇床转速150?200rpm，培养1～7天，得到发酵液，取发酵液于4000?12000rpm离心，取上清液备用；所述发酵培养基的组成为：麦芽糖10?120g/l，葡萄糖10?50g/l，黄豆饼粉5?25g/l，碳酸钙2?10g/l，甘油2?10g/l，谷氨酸钠2?10g/l，溶剂为水，初始pH6.0?7.5；(3)将步骤(2)获得的上清液用水稀释10?100倍，即为待测样品，在96板孔内分别加入唾液淀粉酶30gl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，每1分钟生成1微摩尔产物CNP所需要的酶量定义为1U，5mmol/l的2?氯?4?硝基苯?α?半乳糖?麦芽糖苷40gl，pH6.0、50mmol·L?1磷酸氢二钠?柠檬酸缓冲液90μl，40μl待测样品；对照组为：所述唾液淀粉酶30μl，所述唾液淀粉酶的浓度为0.1U/ml，5mmol/12?氯?4?硝基苯?α?半乳糖?麦芽糖苷40μl，pH6.0、50mmol·L?1磷酸氢二钠?柠檬酸缓冲液130μl，用酶标仪于405nm处检测Abs405，每5秒读一次数，直至Abs405不再增加，将Abs405相对于对照组降低30％以上的样品孔标记为阳性菌株，并保存阳性菌株。