一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法
本发明公开了一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，采用Langendorff灌注装置经主动脉逆行灌流，依次用含钙液、无钙EGTA液、Ⅱ型胶原酶液灌流，收集Ⅱ型胶原酶循环液加入10%BSA溶液，将心室置于其中恒温摇床震荡消化，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，过滤，滤液自然沉降，收集细胞沉淀，悬浮在酶洗脱液中重复沉降即得心肌细胞，该方法获得的大鼠心肌细胞中75-93%都具有活性，每只大鼠心脏的活细胞产量最高可达约（5-8）×108个，本发明采用单一消化酶分离心肌细胞并用逐步梯度复钙法沉降，既简化了实验步骤，又大大提高了心肌细胞的存活率，简单经济，是分离成年大鼠心肌细胞行之有效的方法。
发明专利
CN201210054301.3
2012-03-05
CN102911909A
2013-02-06
C12N5/071(2010.01)I
遵义医学院附属医院
梁贵友;王峰;汤全;肖志超;蔡庆勇
563000 贵州省遵义市大连路149号
贵阳中新专利商标事务所 52100
刘楠%顾书玲
贵州;52
?一种一步酶消化法分离提取成年大鼠心肌细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）装置预处理：设置Langendorff灌注装置恒温于37℃，消毒，超纯水灌流，预充灌注母液；（2）灌流：将成年大鼠离体心脏挂于Langendorff灌注装置上，经主动脉逆行灌流，设置灌注流量为6?10ml/min，用含钙液灌流1?2min，然后用无钙EGTA液灌流4?5min，再用Ⅱ型胶原酶液单向灌流1.5?2.5min，之后循环灌流10?18min；（3）消化：剪下心室肌组织，弃去心房和大血管，收集Ⅱ型胶原酶循环液，加入10%?BSA溶液至BSA终浓度为8?12mg/ml，取5?10ml，将心室置于其中，37℃、130?160次/min恒温摇床震荡消化5?8min，用吸管吹打循环液至消化完全得消化液，从灌注Ⅱ型胶原酶液开始，每4分钟加入0.1mol/L的CaCl2溶液45?55μl，共4次；（4）沉降：用160目滤网过滤消化液，滤液自然沉降15?20min，收集细胞沉淀，悬浮在30ml酶洗脱液中，再自然沉降15?20min，如此重复洗涤2?3次，所得自然沉降物即为心肌细胞；（5）前述步骤中所用的试剂为：灌注母液：NaCl?130?mMol/L、KCl?5.4?mMol/L、HEPES?5?mMol/L、D?Glucose?10?mMol/L、MgCl2·6H2O?3.5?mMol/L、NaH2PO4?0.4?mMol/L，用O2和CO2体积比为95:5的混合气饱和15min，NaOH调节pH至7.20～7.35；10%BSA制备：100mg/mlBSA溶解在含80?mMol/L?Ca2+的灌注母液中，在4℃条件下搅拌混匀，放入含80?mMol/L?Ca2+的灌注母液中4℃透析1h，换新鲜含80?mMol/L?Ca2+的灌注母液，在4℃下静置过夜，然后分装，储存在?20℃备用；含钙液：在灌注母液中加入CaCl2，使Ca2+终浓度为500?750?mMol/L；无钙EGTA液：在灌注母液加入EGTA，使EGTA终浓度为100?mMol/L；Ⅱ型胶原酶液：取灌注母液加入Ⅱ型胶原酶和CaCl2，使Ⅱ型胶原酶和Ca2+浓度分别为0.02?0.06%（质量）和60?90?mMol/L；酶洗脱液：灌注母液中加入10%BSA和CaCl2，使BSA和Ca2+终浓度分别为1mg/mL和80?100?mMol/L。