一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法
本发明涉及动物生殖和分子生物学操作技术领域。具体涉及牛体细胞核移植中供体细胞的选择方法。公开了一种利用抗氧化剂筛选牛核移植供体细胞的方法。为了提高牛核移植效率中的供体细胞的数量,本发明利用活体采样,接种法培养细胞,稳定传代的活力为OD值为0.609±0.053的第六代细胞,用浓度为100μmol/L的β-巯基乙醇处理细胞24h后的细胞作为供体细胞,为重构胚更好的发育奠定了基础。
发明专利
CN201110218955.0
2011-07-30
CN102899353A
2013-01-30
C12N15/873(2010.01)I
华中农业大学
易建明;赵玲玲;宋海泉;杨利国;陶林林
430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
武汉宇晨专利事务所 42001
张红兵
湖北;42
一种筛选牛核移植供体细胞的方法,其特征在于以下步骤:1)剪取牛耳尖端4?5cm2的组织,利用接种法培养得到牛耳组织成纤维细胞;2)在步骤1)的细胞传至2、6、13、20代时分别测定细胞活力,即MTT?OD值;3)挑选细胞活力OD值为0.609±0.053的第六代的细胞,备用;4)用浓度为100μmol/L的β?巯基乙醇处理步骤所得的细胞24h的细胞作为供体细胞;5)取牛卵母细胞在成熟培养液中培养至成熟,备用;6)将步骤5)的牛卵母细胞作为受体,进行核移植,观察并记录重构胚的卵裂率和囊胚率;其中:上述试剂的组分及配制方法如下细胞培养液?1和细胞培养液?2;细胞培养液?1:胎牛血清10ml,青霉素?链霉素抗菌液1ml,用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml;细胞培养液?2:胎牛血清20ml,青霉素?链霉素抗菌液1ml,用杜贝柯氏最小必需培养液定容至100ml;抗氧化剂培养液:向细胞培养液?1中添加β?巯基乙醇,其浓度分别为0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、和150μmol/L,过滤除菌,4℃下保存;成熟培养液:TCM199?26ml;胎牛血清3.0ml;促卵泡激素15μg;促黄体素150ng;雌二醇30μg;表皮生长因子150ng;丙酮酸钠6.6mg;青霉素?链霉素抗菌液0.3ml;过滤灭菌,4℃下保存;胚胎培养液:肌醇0.015g;必须氨基酸900μl;非必需氨基酸300μl;牛血清白蛋白0.09g;青霉素?链霉素抗菌液300μl;丙酮酸盐600μl;Stock?G30μl;Stock?C28ml;过滤灭菌,4℃下保存;各种盐溶液的配制:Stock?A:NaCl1.267g;KCl0.107g;KH2PO40.032g;MgSO4·7H2O0.036g;青霉素?链霉素抗菌液0.2ml;Na?Lactate0.12ml;H2O19.5ml;Stock?B:NaHCO30.21g;H2O10ml;Stock?D:CaCl2·2H2O0.262g;H2O10ml;Stock?G:L?Glucose0.292g;H2O10ml;Stock?C:STOCK?A1.1ml;STOCK?B1.0ml;STOCK?D0.1ml;H2O7.9ml。