HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法
本发明公开了HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法。通过构建HIV-1gp120N端的三分之一片段与IFN-γ(gp120N/IFN-γ)融合基因的原核表达质粒pet44b-gp120N/IFN-γ，并将该质粒在大肠杆菌(DE3)细胞中进行低温诱导表达和鉴定，本发明成功构建了pet44b-gp120N/IFN-γDNA重组体并成功在原核细胞中进行了蛋白表达。通过在体刺激Balb/c小鼠，检测融合蛋白与单纯gp120蛋白在诱导小鼠免疫反应特别是细胞免疫反应的差异，证明了IFN-γ在gp120N/IFN-γ融合蛋白中发挥了免疫佐剂的作用，增强了特异性抗体的产生，更为显著的是，增强了特异性细胞免疫反应包括CTL作用和Th1型细胞因子分泌水平。
发明专利
CN200610052054.8
2006-06-20
CN1944644
2007-04-11
C12N15/09(2006.01)I
浙江大学
吴南屏;赵 刚;靳昌忠
310003浙江省杭州市上城区庆春路浙江大学医学院附属第一医院传染病研究所
杭州中成专利事务所有限公司
冯子玲
浙江;33
权利要求书1、HIV-1gp120与人γ干扰素融合蛋白的制备方法，其特征在于下述步骤：(1)根据pEGFP-N1/gp120质粒图谱，设计gp120/pEGFP-N1的一对引物，在5’端和3’端分别引入Ecor I和Hind III识别位点：A/ATTCT和A/AGCTT，用PCR法高保真扩增gp120N端566bp片段，并纯化PCR产物，备用；(2)参考Genebank E00692设计IFN-γ的一对引物，用LA Tag DNA po1ymerase，以IFN-γ质粒为模板进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物回收、纯化后用T-A克隆的方法插入TOPOT-A克隆载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，抽提TOPO-IFN-γ重组质粒DNA，作ECOR I单酶切鉴定，得到IFN-γ片段；(3)对gp120片段、IFN-γ片段及它们的表达载体Pet44b进行酶切，gp120片段与表达载体Pet44b、IFN-γ片段与表达载体Pet44b分别连接，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个白色菌落扩增，抽提gp120/pet44b和IFN-γ重组质粒DNA，分别作双酶切鉴定，用gp120酶切位点酶切IFN-γ+pet44b质粒，产物与gp120片断连接，得到pet44b-gp120N/IFN-γ表达载体，连接产物转化TOP 10F感受态细胞，挑单个菌落扩增，抽提pet44b-gp120N/IFN-γ重组质粒DNA，并鉴定所得重组质粒；(4)制备BL21(DE3)感受态细胞，取连接产物加入感受态细菌中，转化成功后复苏培养细菌，取菌液，在含氨苄青霉素的LB平板上培养，挑选单个菌落，摇菌、抽提质粒；(5)以PCR法对pet44b-gp120以及pet44b-gp120/IFN-γ重组质粒转化入DE3细胞进行验证；(6)IPTG低温诱导gp120蛋白和gp120/IFN-γ融合蛋白在原核细胞株DE3的表达；(7)冷冻、浓缩并纯化细胞培养上清液，得到均质gp120和gp120/hIFN-γ融合蛋白。