pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法
本发明公开了一种pET-SOD工程菌的构建及其表达纯化方法，本发明通过下述技术方案予以实现：设计引物从念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)中克隆Fe-SOD基因，得到产物重组至质粒pUCm-T，并于大肠杆菌DH5α中克隆；设计引物扩增Fe-SOD基因，重组至原核表达载体pET22b(+)，于大肠杆菌BL21构建成工程菌pET-SOD，并表达纯化出具超氧化物岐化酶活性和一定抗肿瘤能力的Fe-SOD。利用本方法构建的工程菌能在最佳条件下获得非常高效地表达，将解决工业上从动植物中提取SOD的原料限制问题。
发明专利
CN200510061502.6
2005-11-09
CN1962871
2007-05-16
C12N15/53(2006.01)I
浙江大学
龚兴国
310027浙江省杭州市玉古路20号
杭州中成专利事务所有限公司
唐银益
浙江;33
1、一种pET-SOD工程菌的构建方法，其特征依次包括以下步骤：(1)在BG11培养基中培养念珠藻CHEN(Nostoc commune strain CHEN)40～50天，取下层培养物，采用SDS-CATB法抽提念珠藻CHEN基因组；(2)以念珠藻CHEN基因组为模板，用TD-PCR方法扩增Fe-SOD基因，得到产物重组至质粒pUCm-T，重组质粒命名为T-SOD，并于大肠杆菌DH5α中克隆；TD-PCR所用的两种引物为：SOD-for：5’-GAGGATTTGACACGATGGCATTTG-3’SOD-orf：5’-CTGACACCTAATTAAGCTTTGGCC-3’；(3)以T-SOD为摸板，用PCR方法扩增Fe-SOD基因，经Nco I和Xhol I酶切点酶切后重组至相同酶切的表达质粒pET22b(+)上，SOD基因末端与6×His标签的基因序列相连，构建成pET-SOD；PCR所用的两种引物为：SODn：5’-CTAGCCATGGCATTTGTACAGC-3’，含Nco I酶切位点SODx：5’-CCGCTCGAGAGCTTTGGCCAAGTTTTC-3’，含Xhol I酶切位点；(4)将pET-SOD转移至大肠杆菌BL21中完成构建。