实时定量PCR技术检测人21号染色体数目的方法

摘要：

本发明提供检测人21号染色体数目的方法，是应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记。设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术同管扩增这两个序列，通过反映相对量的delta ct值来确定21号染色体的数目并由此诊断21三体综合征。本发明将染色体的数目分析转化为分子信号检测，充分利用分子定量的优势，不仅方法简便、高度敏感、稳定和检测率高，而且还具有高通量和自动化的特点，在临床有极好的应用前景。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510049601.2

申请日期：2005-04-20

公开/公告号：CN1693480

公开/公告日：2005-11-09

主分类号：C12Q1/68

申请/专利权人:浙江大学医学院附属妇产科医院

发明/设计人:吕时铭;朱宇宁;裘 俭;朱 波;尤建飞

主申请人地址:310006浙江省杭州市学士路2号

专利代理机构:杭州求是专利事务所有限公司

代理人:张法高%赵杭丽

国别省市代码:浙江;33

权利要求：

1.检测人21号染色体数目的方法，其特征是：通过应用基因组特异性单拷贝序列作为染色体的分子标记，在21号染色体的唐氏综合征关键区域选择DSCR4基因的部分非多态性片段为目标分子标记，在1号染色体上不易发生缺失或三体的区域选择RABIF基因的部分片段为内参分子标记，分别设计两对引物及相应的Taqman探针，采用多重实时定量PCR技术对目标分子标记和内参分子标记进行同管扩增，通过deltact值来确定21号染色体数目并由此诊断21三体综合征，通过以下步骤实现：(1)选择染色体的分子标记21号染色体上的目标分子标记为GTTGATGGGCTTGCGCTTATCTGCTTGTCCCTTCTCCCATCTGATTTCTTGTGGAGCCCATGG其中上游引物序列：5’-GTTGATGGGCTTGCGCTTAT-3’下游引物序列：5’-CCATGGGCTCCACAAGAAAT-3’Taqman探针序列：5’-Fam-TGCTTGTCCCTTCTCCCATCT-Tamra-3’1号染色体上的内参分子标记为TCAACATGGGCCCCACATGGTCCTAGTTTCCCCGGCTCATTATGCTTCAGGCACACTGGCTTTCTTGC其中上游引物序列：5’-TCAACATGGGCCCCACAT-3’下游引物序列：5’-GCCAGTGTGCCTGAAGCA-3’Taqman探针序列：5’-Vic-TCCTAGTTTCCCCGGCTCATT-Tamra-3’(2)标本制备取新鲜EDTA抗凝全血或羊水，采用QIAampDNABloodMiniKit提取DNA，用紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度；(3)多重实时定量PCR扩增采用ABIPrism7000型荧光定量PCR仪同管扩增目标分子标记及内参分子标记，反应体系25μl，含基因组500-25000拷贝，加入两对引物各500nM，相应Taqman探针200nM，dNTP100μM，Mg+3.5mM，Taq酶5U，ROX200nM，反应条件为95℃5分钟预变性；95℃30秒，60℃30秒，两步法40个循环；(4)定量分析采用ABIPrism7000型荧光定量PCR仪随机附带软件进行定量分析，分析体系设置为0.14，基线范围起点为第6个循环，终点为同板反应最小ct值的前1-3个循环，软件自动输出各扩增片段的ct值，计算deltact值，根据不同的deltact范围来判断21号染色体数目。