大鼠胰岛细胞分离纯化的改良方法
本发明涉及细胞生物学技术领域，是包括涉及用新型Liberase RI酶灌注消化大鼠胰腺，和利用聚蔗糖Ficoll密度梯度离心分离大鼠胰岛细胞的方法。本发明将Liberase RI酶原位灌注大鼠胰腺使之完全膨胀，钝性分离胰腺并置于37℃水浴静止消化。消化物经两层不锈钢筛过滤后，用Ficoll密度梯度(25％，23％，21％和11％)离心纯化胰岛细胞。初步纯化的胰岛细胞培养过夜后，用连有橡皮管的玻璃针经操作者口腔及舌头的控制逐一挑出，从而得到完全纯净的大鼠胰岛细胞，得率1351+23个/胰腺，胰岛细胞进一步用二苯基硫巴腙染色证实。本发明极大地提高了传统分离方法的得率和效率，为降低大规模分离纯化人胰岛的成本奠定了基础，这对晚期糖尿病人的胰岛细胞移植具有重要的实践开拓意义。
发明专利
CN200510040622.8
2005-06-20
CN1699556
2005-11-23
C12N5/06
南京大学
刘 畅;张春妮;王军玲;张辰宇;项 阳;张 燕;朱凌云;戚小强
210093江苏省南京市汉口路22号
江苏;32
1.一种大鼠胰岛细胞的分离纯化方法，其特征在于：a.大鼠胰腺的钝性分离及消化：大鼠麻醉后开腹，结扎胆总管入十二指肠端。破心放血，立即用0.167mg/ml的LiberaseRI酶溶液经胆总管实行胰腺在体原位快速灌注，待胰腺完全膨胀后进行钝性分离。把胰腺放入50ml离心管，加入适量消化液置于37℃水浴静止消化27.5min。消化结束后用漩涡振荡器剧烈振荡离心管10s，加入等量冷PBS终止消化。消化物经两层不锈钢筛(孔径分别为直径1mm和0.5mm)过滤，离心去上清，得到糜状消化终产物；b.胰岛细胞的初步纯化：往消化终产物中加入4ml25％(w/v)Ficoll溶液，振荡混匀，上面逐层加入23％，21％和11％的Ficoll溶液各2ml，形成界面清晰的密度梯度分离液。用吊桶式转头进行离心分离，整个过程不使用刹车，自然加速和减速。在21％和11％的界面中把细胞团吸出，得到初步纯化的胰岛细胞；c.胰岛细胞的精细纯化：初纯化的胰岛细胞培养过夜，第二天用连有橡皮管的玻璃针把胰岛细胞逐一挑出，这个过程需要操作者口腔和舌头的紧密配合。