一种无桔霉素红曲霉基因工程菌的构建方法

摘要：

一种无桔霉素红曲霉基因工程菌的构建方法，属于微生物基因工程领域。本发明提供了(1)来源于CICC5006的桔霉素编码基因pksCT序列；(2)构建CICC5006桔霉素基因的克隆载体pBpksCT和敲除载体pBpksCTHyg；(3)REMI介导CICC5006桔霉素基因敲除方法。利用本发明方法，可以用于阻断红曲霉中桔霉素的代谢途径，进而从根本上解决色素生产过程中桔霉素伴生和污染问题，保证红曲产品的安全性，达到改善红曲产品质量和深度开发的目的。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510039138.3

申请日期：2005-04-28

公开/公告号：CN1687396

公开/公告日：2005-10-26

主分类号：C12N1/15

申请/专利权人:江南大学

发明/设计人:诸葛健;周礼红;方慧英

主申请人地址:214036江苏省无锡市惠河路170号

专利代理机构:无锡市大为专利事务所

代理人:时旭丹

国别省市代码:江苏;32

权利要求：

1.一种无桔霉素红曲霉基因工程菌的构建方法，其特征是：(1)引物设计：以GeneBank公布的M.purpureus桔霉素的基因序列为基础设计引物，pksCT-F：5′-GGCCGCGGCCGCGCTTCTTACCAACTTCCCTT-3′，pksCT-R：5′-GGCCGTTAACACCTTCAGTCCGCTATCTATC-3′；(2)pksCT基因克隆：通过PCR技术，以CICC5006基因组DNA为模板，以pksCT-F、pksCT-R为引物扩增得到4.1kb的桔霉素编码基因片段命名为pksCT；(3)pBpksCT载体的构建：pksCT两端分别引入了NotI和HpaI酶切位点，经纯化回收后分别用NotI和HpaI酶切，插入pBluescriptII(-)的NotI和SmaI位点，构建得到pBpksCT载体；(4)桔霉素基因敲除载体pBpksCTHyg的构建：将来自载体pCB10031.4kb的HpaI酶切片段，该片段含有来自AspergillusnidulanstrpC基因的启动子和hygromycinB抗性基因hph序列，插入载体pBpksCT的SmaI位点，SmaI位点位于pksCT基因序列内2253bp处，构建得到红曲霉桔霉素敲除载体pBpksCTHyg；(5)REMI介导敲除：载体pBpksCTHyg通过REMI介导敲除CICC5006桔霉素基因，构建得到无桔霉素红曲霉基因工程菌。