使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术
本发明涉及一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，包括脐带血造血干细胞的获得，以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用，完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活，以化学法连接抗CD<sub>3</sub>单抗的琼脂堂微载体的制备，CIK细胞的激活和CIK细胞在生物反应器中进行连续培养。本发明以共价方法将单抗连接在微载体上，既提高了单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度；又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活；CIK细胞使用生物反应器进行大规模培养。
发明专利
CN200510035036.4
2005-06-09
CN1699558
2005-11-23
C12N5/08
郑丽琴
郭杰标
512026广东省韶关市芙蓉新城碧岛豪庭A座804
韶关市雷门专利事务所
周胜明
广东;44
1、一种使用生物反应器对造血干细胞来源的细胞因子诱导的杀伤细胞的大规模培养技术，包括脐带血造血干细胞的获得，以细胞因子将造血干细胞诱导成DC细胞、并完成对肿瘤抗原的提呈作用，完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活，以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备，CIK细胞的激活和CIK细胞在生物反应器中进行连续培养，其特征是：所述以化学法连接抗CD3单抗的琼脂糖微载体的制备是以共价方法将单抗连接在微载体上，提高单抗与细胞的接触面积，增大培养空间，提高细胞密度，又可以在空间实现树突状细胞、辅助性T细胞、杀伤性T细胞之间的接触，便于肿瘤抗原的提呈和杀伤性T细胞的选择激活，由于CIK细胞培养实现立体化，所以可以使用生物反应器进行大规模培养，将琼脂糖微载体在pH为10.5-11的0.1MTris缓冲液中和加入溴化氰使终浓度为0.1M，在摇床上20-25℃作用过夜；1500转/分钟离心5分钟，使琼脂糖微载体和溴化氰反应液分离，用pH为11的Tris缓冲液洗涤/离心5次，将活化的琼脂糖微载体风干备用，将琼脂糖微载体和抗CD3抗体以1g/3-5mg的比例，在pH为9.5-10的0.1MTris缓冲液中混合，在摇床上20-25℃作用1小时，使抗CD3抗体充分结合到琼脂糖微载体上，加入足够量的甘氨酸封闭琼脂糖微载体未反应的位点，用DMEM培养液洗涤离心10次，将微载体在4-8℃风干后，用钴60辐照灭菌后备用；所述CIK细胞的激活是将完成对肿瘤具有特异性杀伤作用的杀伤性T淋巴细胞的选择激活中处理过的脐带血造血干细胞以0.8-1×108个细胞/1g微载体的比例混合，在培养瓶中以含有10％胎牛血清和终浓度为300-500ng/ml的IL-2的PMRI1640完全培养基培养，这时脐带血造血干细胞中含有的单核细胞和杀伤性T细胞会在连接和微载体上的抗CD3单抗和IL-2的作用下被激活成为CIK细胞，进入快速生长的状态，在抗CD3单抗的支持下生长8-10天后，CIK细胞会逐渐成熟并摆脱对抗CD3单抗的依赖，这时可以将细胞转入到生物反应器中进行大规模连续培养；所述CIK细胞在生物反应器中进行连续培养：采用搅拌式生物反应器，以搅拌速度60-80转/分钟，溶氧量为45-55％，pH为7.2，温度为37℃，培养基替换速度为1-1.5ml/分钟的条件进行培养，能够为细胞提供稳定而合适的生长条件，而反应器的细胞截留装置使细胞能够保持高密度状态，使CIK细胞能够得到长时间、高密度地培养，当反应器内的细胞密度达到3-5×107之后，就可以每天收集500-800ml的细胞培养液，得到2-4×1010的CIK细胞，剩余的细胞继续在反应器内进行连续培养、连续收集。