分泌肿瘤坏死因子－α的重组卡介苗及其构建方法
本发明涉及一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗及其构建方法，利用基因工程技术将起分泌作用的卡介苗Ag85B信号肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表达载体pMSTNF-α，然后采用电转化技术将pMSTNF-α导入BCG构建重组卡介苗rBCGTNF-α，依靠pMSTNF-α在BCG的复制和信号肽的分泌作用，能够高效分泌TNF-α。本发明得到的重组卡介苗rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的双重效果，能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；利用重组卡介苗rBCGTNF-α在膀胱腔内的局部协同作用减少BCG和外用TNF-α的用量，可以克服BCG治疗的毒副作用。
发明专利
CN200510025777.4
2005-05-12
CN1710073
2005-12-21
C12N15/09
上海交通大学
夏术阶;刘海涛;孙晓文
200240上海市闵行区东川路800号
上海交达专利事务所
毛翠莹
上海;31
1、一种分泌肿瘤坏死因子-α的重组卡介苗的构建方法，其特征在于包括下述步骤：1)卡介苗穿梭表达载体的构建：分别设计Ag85B和TNF-α的扩增引物，Ag85B信号肽的上下游酶切位点分别为BamHI和EcorI，TNF-α的上下游酶切位点分别为EcorI和SalI，经聚合酶链式反应分别合成Ag85B信号肽和TNF-α基因片段，将Ag85B信号肽克隆到pMV261载体中，得到pMS，再将TNF-α基因片段与pMS载体的信号肽连接，得到穿梭表达载体pMSTNF-α；2)卡介苗的培养：选取卡介苗为上海丹麦株，将卡介苗放在含有液体培养基的烧瓶中进行摇床培养，液体培养基含有10％的营养剂ADC、0.5％吐温80和0.2％甘油，摇床培养100转/分，三周后卡介苗处于对数生长期，OD600值＝0.6，制得感受态卡介苗；3)电转化技术构建分泌人TNF-α的重组卡介苗rBCGTNF-α：在一离心管中混匀400μl含1×108cfu的感受态卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表达质粒pMSTNF-α，置于基因脉冲仪中进行电转化得到阳性重组子，电转参数：电压为2500V，电流为25μF，电阻为1000Ω，阳性重组子先在含有50μg/ml卡那霉素的固体培养基中筛选，培养两周后得到阳性克隆rBCGTNF-α，然后接种在含有50μg/ml卡那霉素的液体培养基摇床生长，大量培养；4)重组卡介苗rBCGTNF-α的鉴定与功能检测：进行Z-N法抗酸染色证实为抗酸杆菌，抽提rBCGTNF-α质粒DNA后，PCR扩增得到TNF-α基因片断，WesternBlot检测到rBCGTNF-α培养上清中和菌体中有TNF-α蛋白的表达，ELISA方法检测到rBCGTNF-α培养上清中有高含量的TNF-α。