一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法及应用

引用

摘要：

本发明涉及一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法和应用，属于分子生物学和应用微生物学领域。本发明设计了5对简并引物(共6条)用于快速扩增捕食线虫真菌的胞外丝氨酸蛋白酶基因。本发明设计的5对简并引物序列为：引物1，AARTAYATYGTCAAGYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物2，AARTAYATYGTCGTCYWSAAG/AYRTGDGGRSWRGCCATSGA；引物3，AARTAYATYGTCGTCYWSAAG/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG；引物4，MAWGMTKWYGAACSKYCT/GTRTCRATGACGTAGACKG；引物5，MAWGMTKWYGAACSKYCT/TTAAGYRKHKCCRTTGWAG。本发明以捕食线虫真菌基因组DNA作为模板，通过以上引物快速扩增胞外蛋白酶的编码基因。本发明能够快速扩增捕食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因，具有良好的应用前景。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200510010801.7

申请日期：2005-05-11

公开/公告号：CN1710077

公开/公告日：2005-12-21

主分类号：C12N15/57

申请/专利权人:云南大学

发明/设计人:张克勤;杨金奎

主申请人地址:650091云南省昆明市翠湖北路2号

专利代理机构:昆明大百科专利事务所

代理人:杨宏珍

国别省市代码:云南;53

权利要求：

1、一种快速扩增食线虫真菌胞外丝氨酸蛋白酶基因的方法，包括真菌培养、真菌基因组DNA的提取、用引物进行PCR扩增、扩增片段测序及测序结果分析步骤，其特征在于本方法中所用引物由下列方法设计得到：(1)选择GenBank上发表的下列真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因用于简并引物设计；真菌名称蛋白酶性质GenBank索引号Arthrobotrys表皮降解丝氨酸蛋X94121oligospora白酶(PII)Arthrobotrys中性丝氨酸蛋白酶AF516146oligospora(Aozl)Paecilomyces丝氨酸蛋白酶(Pr)L29262lilacinusVerticillium碱性丝氨酸蛋白酶AJ427460chlamydosporium(VCP1)Beauveria表皮降解丝氨酸蛋AF154118bassiana白酶(Pr)Metarhizium丝氨酸蛋白酶AJ251925anisopliae(PrA)Cordyceps表皮降解蛋白酶AY520815brongniartii(Pr1)Fusariumsp.碱性蛋白酶S71812S-19-5(Alp)Tritirachium丝氨酸蛋白酶X56116album(2)利用生物分析软件DNAman对上述真菌和胞外丝氨酸蛋白酶的编码基因进行比对，并根据它们的保守序列设计出下列5对共6条简并引物：上游引物序列下游引物序列引(5’--3’)(5’--3’)物1AARTAYATYGTCAAGYWSAAGAYRTGDGGRSWRGCCATSGA2AARTAYATYGTCGTCYWSAAGAYRTGDGGRSWRGCCATSGA3AARTAYATYGTCGTCYWSAAGTTAAGYRKHKCCRTTGWAG4MAWGMTKWYGAACSKYCTGTRTCRATGACGTAGACKG5MAWGMTKWYGAACSKYCTTTAAGYRKHKCCRTTGWAG表中的简并碱基代码：M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T，N＝A/G/C/T。

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