克隆原核生物耐盐相关基因方法
克隆原核生物耐盐相关基因方法，涉及基因工程。提供一种克隆原核生物耐盐相关基因的方法。将极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物，提取极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物的总DNA；对总DNA不完全酶切，酶切后的总DNA经凝胶电泳，找酶切片段区域，切出凝胶，回收DNA片段；完全酶切成线性，将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶形成重组质粒，转化用CaCl<sub>2</sub>处理获得的感受态受体菌；将转化子溶液涂抹在高盐和LB琼脂培养基上，挑选转化子；提取重组质粒，插入片段，测序，同源性比较，判定该基因的性质；绘出转化子与对照的生长曲线，比较两者生长状态的差异，借此再次验证该基因为耐盐相关基因。
发明专利
CN200410084812.5
2004-10-01
CN1644706
2005-07-27
C12P19/34
厦门大学
刘广发;谢金镇;陈启伟
361005福建省厦门市思明南路422号
厦门南强之路专利事务所
马应森
福建;35
1、克隆原核生物耐盐相关基因方法，其特征在于其步骤为：1)将极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物，包括各种耐盐细菌和蓝藻接种在含NaCl0.1～0.9mol/L的培养基中，温度为15～32℃，以100～150rpm的速度震荡培养至指数生长中后期；如果是耐盐蓝藻，应在光照下培养；2)常规碱变性法提取极端耐盐假单胞菌或其它耐盐原核生物的总DNA，经紫外光谱检测纯度，其OD260/OD280比值应≥1.8。用1％琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的分子量是否≥21kb，若OD260/OD280比值≥1.8，说明所得DNA较纯，可以进入下一步骤；若OD260/OD280比值＜1.8，说明所得DNA纯度不够，应进一步纯化，直至OD260/OD280比值≥1.8；3)在无菌条件下用限制性核酸内切酶(E.coRI)或其它产生粘性末端的限制性核酸内切酶对上述总DNA在37℃进行60～100分钟的不完全酶切，酶切后的总DNA经含溴乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下找到分子量为1～3kb的酶切片段区域，切出含上述该酶切片段的凝胶，回收其中的DNA片段；4)在无菌条件下以E.coRI在人工构建的表达载体，如pUC18的多克隆位点将其完全酶切成线性，去磷酸化处理，将回收的DNA片段与线性载体共育，加入连接酶在16℃连接10～24小时，形成重组质粒，转化用CaCl2处理获得的感受态受体菌；5)将转化子溶液分别涂抹在高盐和含Amp-Xgal-IPTG的LB琼脂培养基上，培养48～60小时后，挑选既能在高盐琼脂培养基上生长又在含Amp-Xgal-IPTG培养基上菌落呈白色的转化子；6)提取上述至少10个中选耐盐转化子中的重组质粒，用E.coRI切出其中的插入片段，测序；7)将已测知的各个插入片段序列与生物数据库中的信息进行基因和蛋白质的同源性比较，初步判断插入基因的性质；8)检测转化子中外源基因表达的产物以及转化子获得的新功能，判定该基因的性质；9)将各转化子与对照分别接种在含NaCl为0.9～1.0mol/L的高盐液态LB培养基中，在恒温37℃、100～150rpm的摇床中连续培养，此时对照仅能缓慢进行细胞分裂，而各耐盐转化子则较快生长，取样检测其中的含菌数，分别绘出转化子与对照的生长曲线，比较两者生长状态的差异，借此再次验证该基因为耐盐相关基因。