一种高通量直接定向克隆构建重组腺病毒的方法

摘要：

本发明提出了一种能够直接定向与用T₄DNA聚合酶消化经特殊设计的引物扩增的PCR产物进行连接，然后通过抗性筛选，从而一步构建得到重组腺病毒质粒的方法。得到的重组腺病毒质粒经过限制性内切酶PacI线性化，转化哺乳动物包装细胞系，就能够得到成熟的重组腺病毒。利用本发明能够高通量构建重组腺病毒，以尽可能真实的表达哺乳动物cDNA，且构建重组腺病毒的实验周期短，成本低，特别适合大规模表达哺乳动物来源的cDNA。是一个非常有效的构建重组腺病毒的方法。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200410060972.6

申请日期：2004-10-19

公开/公告号：CN1624145

公开/公告日：2005-06-08

主分类号：C12N15/861

申请/专利权人:湖北大学

发明/设计人:马立新;张娟;陶然

主申请人地址:430062湖北省武汉市武昌区宝集安

专利代理机构:武汉金堂专利事务所

代理人:丁齐旭

国别省市代码:湖北;42

权利要求：

1、一种高通量直接定向克隆构建重组腺病毒的方法，主要包括一个已有的腺病毒表达载体和经PCR引物扩增的目的基因，其特征在于通过对已有的腺病毒载体系统进行成功的定点诱变和同源重组的修饰，在该载体中引入了两个唯一的特殊限制性内切酶酶切位点序列和一个抗性基因表达单元，在扩增目标基因的一对PCR引物的5’端分别引进3～5个特定的碱基，在dTTP、或者dATP、或者dGTP、或者dCTP存在条件下，扩增产物经T4DNA聚合酶消化后产生的粘性末端与载体双酶切得到的粘性末端匹配，从而可以定向克隆在经ClaI、AscI双酶切的载体上，转化大肠杆菌，通过抗性筛选及PCR鉴定或功能鉴定得到重组质粒，重组质粒经线性化后，可直接转染腺病毒包装细胞系，得到重组腺病毒粒子。