一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体
本发明一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体属于用分子生物学方法获得的基因工程生物制品。将鸡α干扰素的基因序列通过电转化方式整合到酵母上的特定位置。采用毕赤酵母表达系统表达外源基因，表达外源蛋白的纯度高于70％，经过65636倍稀释发现能完全抑制100-1000TCID<sub>50</sub>的水疱性口炎病毒的攻击。鸡α干扰素对VSV和禽流感病毒的转录、翻译阶段抑制能力尤其明显，对新城疫病毒、传染性法氏囊病毒等也都有较强的抑制作用，而且还有强大抗肿瘤、抗增殖作用，对鸡的马立克氏病毒也具有较强的抑制作用。
发明专利
CN200410041075.0
2004-06-24
CN1594568
2005-03-16
C12N15/21
南京农业大学
陈溥言;蔡梅红
210095江苏省南京市卫岗1号南京农业大学科技处钱宝英
南京经纬专利商标代理有限公司
楼高潮
江苏;32
1、一种重组鸡α干扰素的生产方法，包括：(一)重组到毕赤酵母上的鸡α干扰素的基因序列的扩增A)引物的设计：引物1：5‘AATTCAATTCTGCAACCACCTTCGCCCC’3引物2：5‘CCGATCTAGAGTTTGGGGATTA’3B)鸡全血淋巴细胞总RNA的提取取500μL培养以ConA刺激4～10h的鸡全血分离的淋巴细胞的悬液，向其中加入800μLTripure细胞裂解液，振荡混匀后，置于室温下10min，然后向其中加入200μL氯仿，混匀后于室温下静置5min分钟，再于12000g4℃下离心15min；吸取上清，向其中加入0.5倍体积的异丙醇，充分混匀后于室温下静置15min，随后在12000g4℃下离心10min；排尽管内液体，向管内加入1mL70％乙醇进行洗涤，混匀后，7500g4℃离心5min；弃去液体，待管壁稍干燥后加入20μLDEPC处理的超纯水溶解，即得到鸡淋巴细胞总RNA；C)含有鸡α干扰素基因序列cDNA第一条链的合成用新鲜提取的淋巴细胞的总RNA进行RT-PCR，具体加样如下：细胞总RNA9.2μL5×反转录Buffer4.0μL10mMdNTP2.0μL25mMMgCI20.8μLRnasin1.0μL引物11.0μL引物21.0μL将上述反应混合物于掌式离心机上稍作离心，然后于在PCR仪；上65℃15min后加入反转录酶M-MLV1.0μL，后42℃1h，94℃5min后结束反应；D)PCR反应体系如下：ddH2O34μL10×PCRBuffer4.0μL25mmol/LMg2+1.4μLRT产物10μLrTaq0.6μL总体积50μL在PCR仪上设置94℃5min，随后94℃1min，56℃1min，72℃1min，共30个循环，结束循环后72℃10min；对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定获得的鸡α干扰素基因大小为488bp；(二)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因酵母表达载体的构建与鉴定利用通过RT-PCR扩增的鸡α干扰素成熟蛋白基因有ECORI和XbaI两个酶切位点，把鸡α干扰素成熟蛋白基因切下后与已经同样两种限制性内切酶酶切的pPICZa-A酵母载体相连，再经ECORI和XbaI酶切，切下大小为488bp的条带则可以鉴定为阳性；(三)感受态酵母菌的制备：挑取毕赤酵母X-33平板上的一个单菌落转接于2mlYPD试管中，28℃250rpm恒温摇过夜活化12h后，取500ul的活化后的酵母菌液转接于50ml的含有无菌5mlYPD培养基的三角瓶中，瓶口用三层灭菌纱布扎紧，28℃恒温摇床250rpm摇荡培养20h左右。待菌液OD600＝1.3-1.5时，4℃1500g离心4min收获细胞。细胞依次用1000ml冰预冷水和1000ml冰预冷的1M山梨醇洗涤，4℃1500g离心5min，最后用0.8ml冰预冷的1M山梨醇悬浮菌体，分装不同的ep管后，置4℃待用；(四)含有鸡α干扰素成熟蛋白基因的酵母表达载体电转化入酵母菌