关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法
本发明公开了关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法，包括成纤维细胞条件培养基和IGF-1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选，最后确定培养基配方为：F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/ml insulin+15～20ng/ml IGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml；本发明突破传统培养基只添加表皮生长因子的局限，添加了胰岛素样生长因子，并摸索出这种因子的适宜比例，采用在培养基添加成纤维细胞条件培养基的方法，替代用成纤维细胞共培养的方法。本发明用激素、细胞因子组合及成纤维细胞条件培养基和BSA补充了因不添加血清而导致的营养因子的不足，完全满足表皮干细胞体外长期扩增培养的营养需求，是一种理想的可商品化生产的无血清培养基。
发明专利
CN200410025938.5
2004-03-12
CN1563360
2005-01-12
C12N5/06
西北农林科技大学
杨学义;窦忠英
712100陕西省杨凌邰城路3号
西安通大专利代理有限责任公司
李郑建
陕西;61
1.关中奶山羊表皮干细胞无血清培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)成纤维细胞条件培养基A.无菌采取关中奶山羊颈部皮肤，用0.25％Trypsin+0.02％EDTA处理皮肤块，4℃过夜，使表皮与真皮分离；B.将真皮与表皮间细胞冲洗干净，将真皮切成小块贴于玻璃皿中，每皿3-4块，加培养基：F12+1％BSA+10ng/mlEGF+10ug/mlinsulin+10ng/mlIGF-1+青链抗素100u/ml进行培养；C.当成纤维细胞铺满平皿后，去组织块，将成纤维细胞消化传代以1×105/ml，接种在50mm平皿中，培养48小时后收集培养基，在4000r/分条件下离心30分钟，0.22um滤膜过滤除菌，-20℃保存备用，标为GSFCM；2)IGF-1、EGF、GSFCM适宜添加浓度的筛选在F12+1～1.2％BSA为基础培养基中分别添加EGF，IGF-1，GSFCM的不同设计浓度梯度，按正交试验进行分组，培养所分离纯化的表皮干细胞，并进行细胞计数测其生长曲线，克隆形成率和细胞形态学变化，比较不同组合的优缺点；3)最后确定培养基配方为：F12+1～1.2％BSA+20～25％GSFCM+20～25ng/mlEGF+5ug/mlinsulin+15～20ng/mlIGF-1+0.4～0.6μg/ml氢化可的松+青链霉素100u/ml。