一种用毕赤甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法
本发明涉及一种用毕赤甲醇酵母表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，由LF基因的扩增、重组酵母表达载体的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16、Ade+Muts表型转化子的筛选检测、Ade+Mut<sup>s</sup>菌株的诱导表达、目的蛋白的纯化与鉴定、鉴定正确后转入发酵罐生长等步骤组成，该工艺生产过程简单，产品纯度高，可以开发为饲料添加剂。
发明专利
CN200410024630.9
2004-05-22
CN1584035
2005-02-23
C12N15/81
浙江大学
汪以真;许梓荣;黄海青;胡迎利;刘光富
310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号
杭州求是专利事务所有限公司
张法高
浙江;33
1.一种用毕赤甲醇酵母表达系统表达重组猪乳铁蛋白及其肽的方法，其特征在于，分为以下步骤：1)LF基因的扩增：取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷冻研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到乳铁蛋白或乳铁蛋白肽的cDNA，根据乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆；2)重组酵母表达载体的构建与鉴定：将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化，将目的基因定向克隆进用同样的内切酶双酶切过的转移载体，得到含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因的重组转移载体，转化大肠杆菌DH5α，涂布在含Amp的LB平板上，培养过夜随即挑取平板上生长的菌落，碱法抽提质粒DNA，双酶切及PCR鉴定；3)重组酵母表达载体转化酵母细胞PMAD11或PMAD16：线性化重组表达载体，在透明的1.5ml聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂：75.0μl重组表达载体，终浓度达1.0μg/μL；3～5μL线性化酶，20.0μL缓冲液；轻轻混匀，37℃下放置12～16小时；在此期间根据InvitrogenPichiaExpressionKit进行酵母菌PMAD11或PMAD16感受态的制备，取出100μL与1～3μg上述线性化的重组表达质粒混合液，转入0.2cm电转杯，冰浴5分钟，于BioRadGenePulser电转仪在750V，25μF，∞Ω条件下电转化后，立即加入1mlYPAD在28～30℃静止培养1小时，1500g室温离心3分钟，小心倒净上清，沉淀重悬于100μL的1XYNB，取50μL菌液涂布于MD选择平板上，于28～30℃条件孵育3～4天，观察转化子的生长；4)Ade+Muts表型转化子的筛选检测：将转化菌落分别对应地点在MM和MD选择平板上，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的菌株；接种单菌落于5mlYPD液体培养基中，28～30℃培养16～20小时后离心，收集菌体，用玻璃珠法提取酵母基因组，并以提取的酵母基因组DNA作模板，用酵母载体上通用的引物进行PCR反应，反应条件如下：94℃预变性2分钟，94℃50s，55℃50s，72℃1分钟，共35个循环，最后72℃延伸10分钟；两个引物分别为α-Factor：5-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3和3′AOXI：GAAGAGAAAAACATTAGTTGGC-3′；5)Ade+Muts菌株的诱导表达：接单菌落于10～50mlBMDY液体培养基中，28～30℃培养16-18个小时，培养至OD600＝2.0～10，离心收集菌体，用5mlBMMY培养基重悬，在28～30℃，255rpm进行培养4天，在诱导过程中，每24小时加1次甲醇，终浓度为0.5％，在0，24，36，72，96小时等时间点取500μL发酵液，离心菌体，用10％SDS-PAGE分析产物；6)目的蛋白的纯化与鉴定：表达上清过滤除去菌体残渣，于4℃用终浓度70％的硫酸铵沉淀，10000rpm离心15分钟收集沉淀，用浓度为10mmol/L、PH7.4的磷酸缓冲液溶解，用10mmol/L的PBS透析24小时，期间换透析液3次；上Sephardex50分子筛层析，用上述磷酸缓冲液洗脱；DotELISA检测LF蛋白洗脱峰，一抗为鼠抗his单克隆抗体，二抗为碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG；7)鉴定正确后转入发酵罐生长。