一种制备木瓜蛋白酶的方法

摘要：

一种制备木瓜蛋白酶的方法，属生物技术领域。本发明的方法包括以下步骤：粗酶制备，粗酶活力达到100万单位/克以上；精酶制备，精酶活力达到200万单位/克以上；纯化酶制备，纯化酶活力达到300万单位/克以上；在此基础上制得木瓜凝乳酶，木瓜凝乳酶活力达到200万单位/克以上。本发明的方法，木瓜蛋白酶提纯的纯度高，一般在200万单位/克以上，同时从中还可提取木瓜凝乳酶。用于纯化木瓜蛋白酶。

专利类型：发明专利

申请/专利号：CN200410024540.X

申请日期：2004-08-09

公开/公告号：CN1597946

公开/公告日：2005-03-23

主分类号：C12N9/50

申请/专利权人:王美岭

发明/设计人:王美岭

主申请人地址:250012山东省济南市历下区经十路89号4单元501室

专利代理机构:济南诚智商标专利事务所有限公司

代理人:王汝银

国别省市代码:山东;37

权利要求：

1、一种制备木瓜蛋白酶的方法，步骤为：1)、粗酶制备取新鲜木瓜乳汁，经搅拌使其液化，过滤，加入等量含0.1-0.4mmol/L硫代硫酸钠，0.5-2mmol/L氯化钠和0.01-0.08mmol/L半胱氨酸的溶液，混合均匀后，缓慢加入已溶解的丹宁溶液至浓度达到0.05-0.2％，静置，用盐酸调PH至2.5-5.5，3500r/min离心10-30min，沉淀于50-70℃真空干燥，粉碎后即得粗酶，该粗酶活力达到100万单位/克以上；2)、精酶制备取上述固体粗酶，加入含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的溶液中，其硫代硫酸钠溶液的PH值5.00-8.00，研磨，过滤，滤液用0.05-2mol/L氢氧化钠调PH至7.0-10.0，不断搅动5-20分钟，过滤，滤液中加硫酸铵至40-60％饱和度，20000×g离心30分钟，沉淀用0.05-2mmol/L硫代硫酸钠溶解，再加入硫酸铵至50-60％饱和度，离心，沉淀溶于含0.02-0.06mmol/L半胱氨酸和0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.05-0.02mol/L磷酸缓冲液，磷酸缓冲液PH值为6.5-8.5，加入氯化钠到终浓度5-20％，室温静置20-40分钟，4℃时于16-20小时至结晶析出，冰冻干燥，4℃冰箱保存，该精酶活力达到200-万单位/克以上；3)、纯化酶制备取上述冰冻干燥酶于室温下对0.05-0.2mol/L乙酸钠级冲液透析8-12小时，乙酸钠级冲液的pH为4.0-6.0，然后上2.0cm×2.0cm的SP-SePhadex50柱进行梯度洗脱，洗脱液为含0.05-2mmol/L硫代硫酸钠的0.1-1.0mol/L乙酸钠溶液，流速为0.1-0.6ml/min；分部收集，透析，冷冻干燥，4℃冰箱保存，得纯化酶，该纯化酶活力达到300万单位/克以上。