微生物转化法生产美雄酮的制备工艺
本发明提供一种微生物转化法生产美雄酮的制备工艺，主要包括采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用Girard试剂特异性的分离产物美雄酮和底物，获得符合BP80版标准的产物美雄酮、回收的底物甲基睾丸素可以被该菌株重新转化等步骤。其有益效果是利用微生物转化法生产美雄酮所采用的工艺与化学脱氢法制备相比较，所得产品美雄酮同样都达到BP80版标准的情况下，原料成本降低了40％以上，成品收率提高了30％以上。同时，该生产工艺对周围环境污染非常轻微，几乎没有污染，生产中为常压工作，操作工序简单，无其它危险。生产美雄酮周期短、收率高，可带来较高的经济效益。
发明专利
CN200410018805.5
2004-03-29
CN1563409
2005-01-12
C12P33/02
天津市福兴达精细有机化工有限公司
杜连祥;王致萍;卢继坤;王树立;别松涛
300380天津市西青区辛口镇
天津才智专利商标代理有限公司
吕志英
天津;12
1、一种微生物转化法生产美雄酮的制备方法，其特征是：该方法采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取；通过控制培养期和转化期的相关工艺，并采用Girard试剂特异性的分离产物美雄酮和底物17α-甲基睾丸素，获得符合BP80版标准的产物美雄酮、回收的底物甲基睾丸素可以被该菌株重新转化的具体步骤包括如下：(一)、制备用于转化甲基睾丸素的发酵液(1)、菌种悬液的制备生产菌种为天津科技大学应用微生物教研室保存的简单节杆菌，编号BY31250，将该生产菌株在琼脂斜面上生长1-2天后，4℃保藏待用；其中，制作菌体种子悬液采用的液体为无菌水或新鲜种子培养基，灭菌条件为：121℃，灭菌时间20～25min；(2)、一级种子培养将上述制好的种子悬液加入到含碳源、氮源和无机磷组成的种子培养基中，灭菌条件为120～125℃，灭菌15～25min；在摇床上160r/min转速下，30～33℃培养18～22h，即得适合接种的种子培养物；(3)、二级发酵培养将生长良好的种子按2％～5％v/v的接种量接入到含有玉米浆、酵母膏、葡萄糖、磷酸二氢钾的发酵培养基中；在发酵过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平保持在10％～30％，通过流加20％(w/v)的NaOH来控制pH值在6.7～7.2，培养22～24h，即得适宜于投料的菌体培养液；(4)、底物17α-甲基睾丸素的转化将底物粉碎，粒度14～16μ，在无菌条件下迅速投入到培养好的发酵液中，并加入相对于发酵液体积4％～7％的工业乙醇，投料量为12～20g/L发酵液体积；在转化过程中通过调节发酵罐的通气量、转速和罐压来控制发酵液中溶氧水平在20％～40％，通过流加20％w/v的NaOH来控制pH值在7.0～7.4，转化36～48h；在转化阶段后期，通过薄层层析或高效液相来控制发酵终点；(二)、从发酵液中提取、分离美雄酮该过程包括发酵液过滤、滤饼在甲醇中回流、去除菌体、成腙反应、过滤得粗品以及水解后回收底物的具体步骤包括如下：(1)、发酵液除去菌体转化结束后，将发酵液减压过滤，滤饼烤干，加入为滤饼重量的10～15倍量的甲醇，回流溶解至澄清，回流时间1～2h，过滤除去菌体；(2)、产物的分离与精制在滤液中加入一定量的Girard试剂和冰醋酸，回流4～6小时，减压浓缩，加入8～10倍体积的水，室温搅拌，过滤即得美雄酮粗品，用乙醇或甲醇精制即得质量符合BP80版标准的美雄酮成品；(3)、底物17α-甲基睾丸素的回收在滤液中加入浓硫酸调节pH值在1.5～3.0的范围，室温下静置6～8小时，未转化的底物即可结晶析出，过滤、水洗、干燥即得回收底物，回收底物可以被所用菌种再次转化为符合质量标准的美雄酮。