含乳铁蛋白及其肽的全蚕蛹粉的生产方法
本发明的含乳铁蛋白及其肽的全蚕蛹粉的生产方法是采用杆状病毒为载体，以家蚕蚕蛹为宿主生产与天然乳铁蛋白及其肽生物学活性相似的基因工程产品的。其生产、使用过程安全，不存在对人畜和环境的潜在危险。将本发明生产的全蚕蛹粉用作饲料添加剂，在补充饲料蛋白的同时起到杀菌抗病毒、提高动物自身的免疫力的作用，可有效地防治断乳仔猪的腹泻，以生产出无抗生素残留的高品质畜产品。
发明专利
CN200410016758.0
2004-03-02
CN1560261
2005-01-05
C12N15/86
浙江大学
汪以真;许梓荣;黄海青
310027浙江省杭州市西湖区玉古路20号
杭州求是专利事务所有限公司
韩介梅
浙江;33
1.含乳铁蛋白及其肽的全蚕蛹粉的生产方法，包括以下步骤：1)取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷冻，研磨成粉末，提取总RNA并通过反转录得到乳铁蛋白或乳铁蛋白肽的cDNA，根据乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因特征设计一对各带一个酶切位点的引物，利用RT-PCR技术得到DNA，定向克隆入大肠杆菌克隆载体，转化大肠杆菌克隆菌株，筛选阳性克隆；2)将以上筛选出的阳性菌株抽提质粒，用DNA内切酶切出目的基因并纯化之，将目的基因定向克隆进杆状病毒转移载体，得到含乳铁蛋白重组转移载体，同时线性化杆状病毒表达载体，在透明的聚苯乙烯灭菌管中加入下列试剂：浓度1.0μg/μL的重组杆状病毒转移载体15.0μl、浓度1.0μg/μL线性化的杆状病毒表达载体1.0μL、灭菌水10.0μL、脂质体14.0μL，轻轻混匀，常温下放置15分钟，在此期间待转染的家蚕细胞吸去培养基，用无血清TC-100培养基洗三次，最后加入2mL无血清TC-100培养基，15分钟以后，用移液器吸取上述40.0μL共转染试剂，分三处滴入细胞中，轻轻摇匀，然后用封口膜密封，27℃培养5天；3)待细胞贴壁后，吸去培养液，将母液按10-3、10-4、10-5的浓度梯度进行稀释，吸取1μL的病毒稀释液接种到贴壁细胞中，摇动使之均匀，27℃感染1小时后，移去接种液，在病毒接种时将3％低熔点琼脂糖熔化，保温在40℃水浴中，然后与等体积预热到40℃的含20％胎牛血清2×TC-100快速混合均匀，将此混合液轻轻加到已移走接种液的贴壁细胞上，等胶凝固后封口，逐日观察病毒斑生长情况，当病毒斑明显后，在显微镜下挑取分隔良好的12个病毒斑，接种于5×104细胞密度且已贴壁生长的24孔板中，至细胞呈感染态时，收集病毒液，向残余的细胞中添加100μgX-gal的溶液，37℃温育1小时后，选取白斑按上述步骤3进一步筛选，重复筛选至获得含乳铁蛋白或乳铁蛋白肽基因的重组杆状病毒；4)将纯化的重组病毒穿刺家蚕蚕蛹，26-30℃放置，待蚕蛹发病后收集病蚕蛹，匀浆，50℃烘干制成蚕蛹粉。