一种农杆菌介导的水稻转化方法
本发明公开了一种农杆菌介导的水稻转化方法。具体地讲是利用双元细菌人工染色体(BIBAC)载体，通过含有毒性助手质粒pCH32的农杆菌菌株LBA4404介导，将来源于药用野生稻基因组120Kb的大片段外源DNA采用优化的转化体系导入到栽培稻H1493中。通过报道基因(gus)、聚合酶链式反应(PCR)检测和Southern分子杂交等对转基因植株进行鉴定和验证，表明在水稻中实现了大片段DNA的转化。该方法为植物基因克隆与功能分析、性状改良等开辟新的途径。
发明专利
CN200410012741.8
2004-02-20
CN1560260
2005-01-05
C12N15/82
武汉大学
何光存;何瑞锋;祝莉莉
430072湖北省武汉市武昌珞珈山
武汉宇晨专利事务所
王敏锋
湖北;42
1.一种农杆菌介导的水稻转化方法，它包括下列步骤：A)愈伤的诱导：选取新鲜无病的栽培粳稻品系H1493成熟种子，去壳，用70-75％乙醇浸洗1-2min，再用0.1-0.15％HgCl2进行表面消毒15-20min，然后用无菌水充分浸洗，将消毒的种子放在灭过菌的滤纸上吸干后转到诱导培养基上，每皿放10-12粒种子，在25-28℃避光培养13-15天，诱导培养基为：N6，脯氨酸0.8-1.2g/l，水解酪蛋白0.2-0.6g/l，2，4-D1.5-2.5g/l，蔗糖40-50g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0，混匀即可；B)继代和预培养：13-15天后剥取新鲜、亮黄色的盾片愈伤并转到诱导培养基上继代培养13-15天，生长良好的胚性愈伤再转到预培养基上培养3-6天，预培养培养基为：N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D1.5-2.5g/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.4-5.6；C)农杆菌的准备与悬浮：从药用野生稻BIBAC基因组文库中选取一个120Kb的克隆114G9，按常规方法提取该克隆的质粒DNA，通过电击转化的方法将该质粒转到含有毒性辅助质粒pCH32的LBA4404农杆菌菌株中，再将该菌株接种到含50-60mg/l卡那霉素的LB固体培养基上，28-30℃培养2-3天，刮取菌苔重新悬浮于农杆菌悬浮培养基，在28-30℃悬浮培养2-3h后使OD600为1.0-1.2，将预培养3-6天的新鲜愈伤集中转到悬浮的菌液中，以80-100r/min浸染15-20分钟，农杆菌悬浮培养基的配方为：N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH5.5-5.7.用前加100-200μM乙酰丁香酮；D)共培养：滤去菌液，将浸染的愈伤转到无菌的滤纸上吸干，再转到共培养基上，21-24℃黑暗共培养2-4天，共培养基为：N6，脯氨酸0.4-0.8g/l，水解酪蛋白0.4-0.8g/l，2，4-D1.5-2.0g/l，麦芽糖30-35g/l，pH5.5-5.7，组织培养胶2.8-3.0g/l.用前加100-200μM乙酰丁香酮；E)农杆菌的去除与过渡培养：共培养后的愈伤用无菌水充分洗涤4-6次，直至洗过愈伤的水溶液变清亮，再用加入浓度为300-400mg/L的噻孢霉素的无菌水洗2-3次，每次15-20min，用无菌滤纸吸干愈伤并转到过渡培养基上培养5-10天，过渡培养基为：N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0.用前加300-400mg/l噻孢霉素；F)选择培养：过渡培养的愈伤再转到选择培养基上，随后每隔13-15天换一次培养基，选择一般持续6-8周，选择培养基为：N6，脯氨酸1.0-1.4g/l，水解酪蛋白0.4-0.6g/l，2，4-D2.0-2.5g/l，蔗糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0.用前加200-300mg/l噻孢霉素和40-60mg/l潮霉素；G)预分化与分化再生：经选择后的抗性愈伤转到预分化培养基培养7-10天后再转到分化培养基进行光照培养，每天光照16-20h，光照强度100-120μmolm-2s-1，培养2-4周，预分化培养基为：MS，水解酪蛋白1.5-2.5g/l，KT1.5-2.5mg/l，NAA0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0，分化培养基为：MS，KT2.5-3.0mg/l，NAA0.2-0.5mg/l，麦芽糖30-35g/l，组织培养胶2.8-3.0g/l，pH5.8-6.0；H)生根与移栽：待小苗长至2-4cm时转到装有生根培养基的试管中生长2-3周，生长良好的小苗经2-3天的炼苗后便可移栽到温室中，生根培养基为：1/2MS，NAA0.2-0.5mg/l，蔗糖10-15g/l，组织培养胶2.5-2.8g/l，pH5.8-6.0.用前加40-60mg/l潮霉素。